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反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究

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反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究

作者：郭倩南华大学

学位级别：硕士

耐药结核病尤其是耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB,)及广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB,)的出现和流行成为了全球重点关注的公共卫生问题及社会问题。长期以来,以细菌培养为基... 详细信息

耐药结核病尤其是耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB,)及广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB,)的出现和流行成为了全球重点关注的公共卫生问题及社会问题。长期以来,以细菌培养为基础的传统药敏试验被视为金标准广泛应用于临床,但其耗时长,结核病患者在初期得不到及时有效的治疗而延误病情。新兴的分子生物学方法在部分一线抗结核药物中已经取得了良好的检测效果,几乎可以与表型药敏试验相媲美,但它们需要特殊的仪器试剂,且在二线药物检测中应用较少。而反向斑点杂交(Reverse dot blot hybridization,RDBH)是一种基于基因扩增上的分子杂交技术,具有快速、简便、高效、直观等特点。本研究旨在建立一种能同时检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对四种一线和四种二线抗结核药物耐药性的RDBH技术,以实现耐药结核病的全面快速检测,为有效防治耐药结核病提供新的技术手段。分别针对结核分枝杆菌八种药物,包括四种一线抗结核药抗结核药异烟肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampicin,RIF)、链霉素(Streptomycin,SM)、乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)和四种二线抗结核药氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、阿米卡星(Amikacin,AMK)、卷曲霉素(Capreomycin,CPM),主要耐药相关基因及常见的突变位点,设计合成46条氨基标记的特异性寡核苷酸探针。通过小样本试验优化RDBH技术条件,建立RDBH技术,并对326株和170株MTB临床分离株分别进行一线、二线抗结核药物耐药性检测,采用比例法药敏试验和DNA测序结果作对照,初步评价该技术的检测效能。经过实验条件的反复优化,最终确定了探针序列、探针终浓度为0.5?M、杂交盐离子浓度为5×SSPE/0.1%SDS、最适杂交温度60℃、洗膜温度50℃、POD-TMB为显色体系。同时应用比例法药敏试验、DNA测序和RDBH技术分别对326株和170株MTB临床分离株进行了INH、RIF、SM、EMB四种一线抗结核药物和OFX、KAN、AMK、CPM四种二线抗结核药物的耐药性检测,以比例法作参照,RDBH检测INH、RIF、SM、EMB、OFX、KAN、AMK和CPM的敏感度分别为84.5%(185/219)、86.5%(166/192)、72.3%(120/166)、55.4%(51/92)、62.8%(59/94)、56.0%(14/25)、61.5%(8/13)和45.0%(9/20);特异度分别为95.3%(102/107)、95.5%(128/134)、91.3%(146/160)、82.1%(192/234)、100.0%(76/76)、100.0%(145/145)、98.7%(155/157)和99.3%(149/150);Kappa值分别为0.75、0.80、0.63、0.37、0.60、0.68、0.57和0.37;以DNA测序为为参照,八种药物耐药性检出率分别为97.9%(189/193)、97.7%(171/175)、97.8%(134/137)、82.0%(91/111)和93.7%(59/63)、92.9%(13/14)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10);特异度分别为99.2%(132/133)、97.4%(148/152)、100.0%(189/189)、99.1%(213/215)和100.0%(107/107)、99.4%(155/156)、99.4%(159/160)、99.4%(159/160);Kappa值分别为0.97、0.96、0.98、0.84、0.95、0.92、0.89和0.89。本研究建立的反向斑点杂交技术对结核分枝杆菌八种药物的耐药性具有良好检测效果,为开发快速检测耐药性试剂盒奠定基础,在结核病一、二线八种抗结核药物耐药性检测和监测上具有良好的应用前景。

关键词：结核分枝杆菌反向斑点杂交技术耐药性耐药相关基因

检测乙肝病毒preS基因常见突变位点的反向斑点杂交技术的建立

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重庆医科大学学报 2013年第9期38卷 1036-1039页

作者：胥飚杨致邦重庆医科大学附属第一医院检验科重庆400016 重庆医科大学基础医学院实验教学中心病原生物学与免疫学实验室重庆400016

目的:利用反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术建立用于检测乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)preS基因常见突变位点的方法。方法:根据HBV preS基因变异中的第35、39、48、155、165位氨基酸突变,分别设计寡核苷酸探针,利用RDB技术对3... 详细信息

目的:利用反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术建立用于检测乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)preS基因常见突变位点的方法。方法:根据HBV preS基因变异中的第35、39、48、155、165位氨基酸突变,分别设计寡核苷酸探针,利用RDB技术对38例HBV患者突变位点进行检测,并与测序结果进行比较。结果:与测序结果符合率达100%。结论:RDB技术可一次性筛查多个不同位点的突变,方便快捷,费用低,对于临床进行HBV preS基因突变检测,判断HBV感染患者的疗效及预后有一定意义。

关键词：乙肝病毒 preS基因突变位点反向斑点杂交技术

反向斑点杂交技术诊断β-地中海贫血误诊分析

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中华妇幼临床医学杂志（电子版） 2009年第3期5卷 64-65页

作者：易萍李力谢海长钟小林陈竹钦第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科重庆400042

β-地中海贫血（β—thalassemia）是一种以β珠蛋白肽链合成缺陷为特征的遗传性溶血性贫血，是世界最常见遗传性单基因疾病之一，绝大多数均为β珠蛋白基因点突变和少数碱基缺失或插入引起。研究表明，反向斑点杂交技术是检测β-地中... 详细信息

β-地中海贫血（β—thalassemia）是一种以β珠蛋白肽链合成缺陷为特征的遗传性溶血性贫血，是世界最常见遗传性单基因疾病之一，绝大多数均为β珠蛋白基因点突变和少数碱基缺失或插入引起。研究表明，反向斑点杂交技术是检测β-地中海贫血突变位点行之有效的方法。

关键词：反向斑点杂交技术 β-地中海贫血误诊分析技术诊断遗传性溶血性贫血 β珠蛋白单基因疾病基因点突变

反向斑点杂交技术用于β地中海贫血的基因诊断及产前诊断

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实用医学杂志 2005年第15期21卷 1710-1711页

作者：梁玉全周远青梁瑞莲广东省佛山市顺德区第一人民医院检验科 528300

目的:了解广东顺德地区β地中海贫血的基因突变类型及频率,降低β地中海贫血重症患儿的出生率,提高人口素质。方法:209例经血液学筛查疑为β地中海贫血患者全血,8例产前胎儿羊水细胞,用反向斑点杂交技术进行基因突变类型检测及分析。结... 详细信息

目的:了解广东顺德地区β地中海贫血的基因突变类型及频率,降低β地中海贫血重症患儿的出生率,提高人口素质。方法:209例经血液学筛查疑为β地中海贫血患者全血,8例产前胎儿羊水细胞,用反向斑点杂交技术进行基因突变类型检测及分析。结果:209例可疑β地中海贫血患者共检出115例8种β地中海贫血基因突变类型;8例产前胎儿基因诊断中,确定正常胎儿2例,β地中海贫血杂合子4例,双重杂合子及纯合子各1例。结论:反向斑点杂交技术不仅可用于β地中海贫血大样本的基因频率筛查,更能对β地中海贫血高风险胎儿做出快速的产前诊断。

关键词：反向斑点杂交技术 β地中海贫血基因诊断产前诊断

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

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中国实验血液学杂志 2002年第2期10卷 148-152页

作者：黄以宁廖灿汤雪薇李焱谢杏梅曾瑞萍广州市妇婴医院广州市脐血库广州510180 中山医科大学医学遗传教研室广州510089

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率 ,但操作过程复杂 ,仅适于大样本的HLA分型。PCR SSP基因分型方法分辨率较低 ,但操作过程简单 ,适于临床要求。有必要建立一种简便、快... 详细信息

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义。常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率 ,但操作过程复杂 ,仅适于大样本的HLA分型。PCR SSP基因分型方法分辨率较低 ,但操作过程简单 ,适于临床要求。有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法。本研究取 6 3份已知HLA DRB型的脐血标本 ,经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交 (RDB)基因分型 ,同时采用SSOP和PCR SSP方法进行比较。结果表明 ,所有样本用RDB方法基因分型均获得成功 ,可准确地分辨 6 0个HLA DRB等位基因 ,且结果与用SSOP和PCR SSP方法的结果完全一致。结论提示 ,RDB方法可准确地分辨HLA DRB等位基因 ,分辨率高 ,操作简单。

关键词：反向斑点杂交技术 HLA-DRB基因分型脐血特异性序列引物PCR 序列特异性寡核苷酸探针白细胞抗原

反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌8种药物耐药性的研究

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基层医学论坛 2020年第8期24卷 1123-1124页

作者：周小宇陈新平黄文怡桑彧菁都昌县第二人民医院江西都昌332600

目的探讨利用反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌的8种药物耐药性效果。方法选取我院门诊、住院部收治的102例复诊肺结核患者痰液标本,建立反向斑点杂交技术,并对肺结核一线治疗药物、二线治疗药物(共8种)进行耐药性试验,金标准为药... 详细信息

目的探讨利用反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌的8种药物耐药性效果。方法选取我院门诊、住院部收治的102例复诊肺结核患者痰液标本,建立反向斑点杂交技术,并对肺结核一线治疗药物、二线治疗药物(共8种)进行耐药性试验,金标准为药敏试验,探讨检测结果。结果反向斑点杂交技术对异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、卡那霉素(KAN)、氧氟沙星(OFX)、卷曲霉素(CPM)、阿米卡星(AMK)的检测正确率分别为83.33%,85.71%,94.44%,100.00%,83.33%,100.00%,100.00%,75.00%,93.75%。结论在对结核分枝杆菌的8种耐药性检测中,反向斑点杂交技术具有良好的检测效果,为快速检测耐药性试剂盒的开发奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌反向斑点杂交技术 8种药物耐药性

反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种的应用评价

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中国卫生检验杂志 2017年第23期27卷 3398-3400页

作者：李爱华张国龙沈青玉杨立涛王伟河南省胸科医院检验科河南郑州450008

目的评估反向斑点杂交技术(reverse blot hybridization assay,REBA)检测结核分枝杆菌(MTB)与非结核分枝杆菌(NTM)在临床诊断中的应用价值。方法采用对硝基苯甲酸(PNB)初筛、REAB检测及核酸测序方法检测河南省胸科医院临床不同结核病患... 详细信息

目的评估反向斑点杂交技术(reverse blot hybridization assay,REBA)检测结核分枝杆菌(MTB)与非结核分枝杆菌(NTM)在临床诊断中的应用价值。方法采用对硝基苯甲酸(PNB)初筛、REAB检测及核酸测序方法检测河南省胸科医院临床不同结核病患者痰标本罗氏培养分离出的分枝杆菌78株,探讨3种方法鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌结果的一致性。结果 REBA检测78株分枝杆菌菌型,73株属结核分枝杆菌复合群,4株为非结核分枝杆菌,1株鉴别为混合菌;与核酸测序检测结果符合率为98.7%(77/78),一致性极好(Kappa=0.99);验证REBA与PNB初筛结果显示,符合率为94.9%(74/78),两法结果一致性好(Kappa=0.95)。结论利用REBA对临床分离的分枝杆菌进行菌种鉴定是一种快速、简便和准确的方法,可满足早诊断,早治疗的临床需要。

关键词：分枝杆菌结核分枝杆菌非结核分枝杆菌反向斑点杂交技术

反向斑点杂交技术应用于人乳头瘤病毒基因分型的研究

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中华检验医学杂志 2006年第7期29卷 658-658页

作者：何桂蓉李芳芳何林甘志彪方红辉暨南大学医学院附属第二医院深圳市人民医院检验科分子生物学室 518020

人乳头瘤病毒（HPV）感染、传播是宫颈癌与尖锐湿疣发生的重要病因，且HPV多重感染是宫颈癌的一个极其重要的危险因素。目前，已经确定的HPV型别有100多种，其中42种与生殖道疾病有关，不同地区HPV感染类型有较大差异。本研究利用反向... 详细信息

人乳头瘤病毒（HPV）感染、传播是宫颈癌与尖锐湿疣发生的重要病因，且HPV多重感染是宫颈癌的一个极其重要的危险因素。目前，已经确定的HPV型别有100多种，其中42种与生殖道疾病有关，不同地区HPV感染类型有较大差异。本研究利用反向斑点杂交法，可同时检测23种HPV型别，包括18种高危型与5种低危型。

关键词：人乳头瘤病毒反向斑点杂交技术病毒基因分型 HPV型别反向斑点杂交法多重感染生殖道疾病尖锐湿疣危险因素感染类型

聚合酶链反应和反向斑点杂交技术检测人乳头瘤病毒感染

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包头医学院学报 2017年第2期33卷 29-30页

作者：罗锦彬林健谊惠州市第六人民医院检验科广东惠州516211

目的:研究聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术在人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染检测中的情况,进一步研究其应用价值。方法:收集2013年3月至2015年6月宫颈癌、尖锐湿疣... 详细信息

目的:研究聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术在人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染检测中的情况,进一步研究其应用价值。方法:收集2013年3月至2015年6月宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变三种类型疾病共320例脱落细胞标本,采用PCR和RDB杂交技术对HPV基因型进行检测,分析检测数据。结果:在宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变的感染中HPV单基因型感染均多于多重基因型感染,但不同疾病中单基因型感染患者比率差别不明显,分别为82.50%、84.06%、84.30%;不同疾病中多重基因型感染患者例数分别为17.50%、15.94%、15.70%,两种类型感染情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);320例标本中检测出的210例阳性标本进行分型,反复检验后数据显示HPV16为最主要的感染基因型。结论:PCR和RDB技术是HPV基因型检测的有效方法,也是关于进行HPV感染防治的有效检测指标。

关键词：基因分型聚合酶链反应反向斑点杂交技术人类乳头瘤病毒