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靶向NOB1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞SKOV3影响的体外研究

靶向NOB1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞SKOV3影响的体外研究

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作者：黎雁英桂林医学院

学位级别：硕士

目的:通过观察NOB1反义寡核苷酸（NOB1-ASODN）对人卵巢癌细胞株SKOV3内NOB1基因及其mRNA表达的影响，和其对SKOV3细胞的生长繁殖、细胞的凋亡及侵袭力的作用，初步探讨NOB1基因在卵巢癌发生发展中的可能作用。为进一步研究其在卵巢癌... 详细信息

目的:通过观察NOB1反义寡核苷酸（NOB1-ASODN）对人卵巢癌细胞株SKOV3内NOB1基因及其mRNA表达的影响，和其对SKOV3细胞的生长繁殖、细胞的凋亡及侵袭力的作用，初步探讨NOB1基因在卵巢癌发生发展中的可能作用。为进一步研究其在卵巢癌及其他肿瘤在其发生、发展的过程中分子调节机制;同时为寻找肿瘤靶基因治疗的研究提供新的线索和参考依据。方法：1、设计合成针对NOB1mRNA的特定NOB1-ASODNs序列以及作为对照的无义寡核苷酸片段NOB1-NSODNs，应用转染载体X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent将NOB1-ASODNs及NOB1-NSODNs转染至人卵巢癌SKOV3细胞中。实验分空白对照组、转染试剂对照组、无义链(NOB1-NSODN)对照组及(NOB1-ASODN)处理组，在倒置荧光相差显微镜下观察转染后24h不同浓度（0.75μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg/ml）的NOB1-ASODN后各组细胞形态的变化，同时连续进行细胞计数7天,取其均值绘制细胞生长曲线图,选择对细胞影响最大的浓度进行后期实验。2、采用RT-PCR方法从核酸水平检测转染后各组细胞NOB1mRNA的表达情况。3、MTT法检测在3.0μg/ml浓度的反义核苷酸转染后不同作用时间段（24h、48h、72h）下对各组SKOV3细胞的体外增殖抑制效应。4、采用Hoechst33258染色法在倒置荧光显微镜下观察转染后48h各组SKOV3细胞凋亡形态。5、流式细胞术检测和分析转染24h不同处理组SKOV3细胞的早期凋亡率。6、利用Transwell小室法检测转染24h后个处理组SKOV3细胞侵袭能力的改变。结果：1、观察到NOB1-ASODN能成功转染入SKOV3细胞，经过不同浓度组的NOB1-ASODN作用后的细胞,细胞的形态出现明显改变：边缘不整齐、欠光滑、细胞间隙可见较多散在的细胞细胞碎片,同时伴随凋亡小体形成，其中以3.0μg/ml浓度组的作用最明显,三个对照组的细胞形态无明显改变,细胞生长状态良好;同时所绘制的细胞生长曲线图显示，最高浓度组对细胞生长抑制效果最明显，与对照组比较，差异存在统计学意义（P＜0.05），选取3.0μg/ml的转染浓度进行后续实验。2、RT-PCR结果提示，转染后48h，NOB1-ASODN能有效下调NOB1mRNA的表达水平，且NOB1mRNA的抑制率达59.58%，与其余3个对照组相比，差异存在统计学意义（P＜0.01），NOB1-NSODN对照组、转染试剂对照组以及空白对照组之间的差异不存在统计学意义（P＞0.05）。3、NOB1反义寡核苷酸对SKOV3细胞具有生长抑制作用，且具有一定的时间依赖性，细胞抑制率在转染后24h、48h、72h分别平均达到：37.02%、56.16%、58.10%;与对照组相比，差异存在统计学意义（P＜0.01），3个对照组之间细胞受抑制情况的差异不存在统计学意义（P＞0.05）。4、在荧光显微镜下观察，经过NOB1-ASODN作用48h后的SKOV3细胞出现体积变小、呈不规则状态、胞核出现染色质聚集,同时可见核碎解，表现出细胞凋亡的形态。而转染NOB1-NSODN组、转染试剂对照组、空白对照组的细胞其细胞核呈现均质淡染的蓝色荧光，核呈圆形或椭圆形、比较规则饱满。5、经NOB1-ASODN作用后，SKOV3的细胞凋亡率明显升高，与NOB1-NSODN对照组、转染试剂对照组以及空白对照组之间对比,差异存在统计学意义（P＜0.01），各个对照组之间细胞凋亡率相比较,差异不存在统计学意义（P＞0.05）;6、Transwell小室侵袭实验显示，NOB1-ASODN处理组平均每高倍视野下细胞穿膜数目明显减少，同对照组相比，差异存在统计学意义（P＜0.01），余3个对照组之间细胞穿膜数目的差异不存在统计学意义（P＞0.05）。结论：1、NOB1-ASODN可成功转染入人卵巢癌细胞株SKOV3中;NOB1-ASODN能有效抑制人卵巢癌细胞株SKOV3内NOB1基因的表达，能下调其靶基因NOB1mRNA的表达水平。2、NOB1-ASODN能抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的生长增殖，同时可促进细胞的凋亡和减弱其侵袭能力。NOB1可能在人卵巢癌的发生发展以及侵袭转移过程中的起非常重要的作用，在其他肿瘤中可能起到相关的作用，NOB1基因可能成为肿瘤基因治疗中的新靶点。

关键词：反义寡核苷酸链卵巢癌 NOB1基因 SKOV3

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