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采用rnai技术抑制‘澳洲青苹’苹果多酚氧化酶的研究

采用RNAi技术抑制‘澳洲青苹’苹果多酚氧化酶的研究

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作者：李玉玲南京农业大学

学位级别：硕士

本研究以APPO为目的基因，通过农杆菌介导方法转化入‘澳洲青苹’苹果，采用rnai技术，以期获得抗褐化的优良转基因苹果。通过研究影响农杆菌介导的‘澳洲青苹’苹果的遗传转化的因素，优化了‘澳洲青苹’苹果的遗传转化体系，建立了高... 详细信息

本研究以APPO为目的基因，通过农杆菌介导方法转化入‘澳洲青苹’苹果，采用rnai技术，以期获得抗褐化的优良转基因苹果。通过研究影响农杆菌介导的‘澳洲青苹’苹果的遗传转化的因素，优化了‘澳洲青苹’苹果的遗传转化体系，建立了高效遗传转化体系，初步获得了携带DSAPPD为目的基因的苹果抗性苗。实验内容和研究结果如下： 1．‘澳洲青苹’苹果无菌营养繁殖系的建立：研究了不同的消毒处理对外植体的影响及Vc、Ac、PVP、枝条遮光处理、低温暗处理对‘澳洲青苹’苹果初代培养中褐化的抑制效果。试验结果表明，70％酒精表面消毒30秒后用0.1％升汞浸泡消毒5分钟，再用无菌水冲洗5次，80％都没有污染。而对抑制褐变最佳的方案是幼芽用0.2％PVP浸泡后接种在含有Vc的培养基上低温暗培5-7天对褐变的抑制率可以达到最佳，‘澳洲青苹’苹果初代的成活率可以达到90％。 2‘澳洲青苹’苹果再生体系的建立以‘澳洲青苹’苹果试管苗的叶片为外植体诱导不定芽再生，研究不同浓度的BA、TDZ、暗培养时间、叶片放置方式和AgNO对叶片不定芽再生的影响。结果表明：最适宜的叶片不定芽再生的培养基为MS+TDZ2.0mg／L+NAA0.3mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L或MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L，最适的暗培养时间是20d，不定芽的诱导率分别达到100％和91.7％。 3．‘澳洲青苹’苹果遗传转化体系的建立以‘澳洲青苹’苹果的叶片为受体，确立了‘澳洲青苹’苹果的选择压，适宜的卡那霉素选择压10-25 mg／L．通过对影响遗传转化效率因子：共培养时间、培养基、抗生素种类、浓度、农杆菌浸染时间和卡那霉素选择压的优化，得出了较高转化效率的体系。浸染时间5 min，共培养时间3-4 d，卡那霉素选择压为12.5 mg／L。抗性愈伤率可以达到93.8％，抗性芽率可以达到14.1％。 4．转基因苹果的检测通过GUS组织化学染色法，得到了4株GUS阳性植株，通过PCR检测间隔区YYT-1初步证明了目的基因已经整合到植物基因组。

关键词：双链rnai PPO基因 ‘澳洲青苹’苹果遗传转化 PCR

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苹果多酚氧化酶双链RNA干扰（dsrnai）研究

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰（dsRNAi）研究

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作者：曹艳红南京农业大学

学位级别：硕士

rnai是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达调控与功能的一项崭新的基因沉默技术，是由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解... 详细信息

rnai是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达调控与功能的一项崭新的基因沉默技术，是由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。以成熟苹果果实的RNA为模板，经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段。以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW+crtY)融合基因片段YYT为间隔区，将APPO反义基因，片段、YYT和AP20正义基因片段串联，将构成的全长为2444bp的DNA插入植物双元载体pYPX145，构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草核基质结合区(SAR)序列，利于转基因的稳定遗传。通过研究影响苹果离体叶片再生频率的内，外因子确立了长富2号单果离体叶片高效、稳定的再生体系，取继代培养28～35d试管苗的第3～5节位的处于生理活性期的叶片，前期暗培养20d，培养基采用GMS：N量保持不变，以(NH)SO代替NHNO并附加300mg/L的CH、激素种类、浓度及其配比如下，GMS+TDZ2.0mg/L+NAA0.6mg/L+CH300mg/L，再生频率达95％以上。在遗传转化体系中，利用分步筛选的方法，在选一培养基GMS+TDZ2mg/L+NAA0.6mg/L+CH300mg/L+Km12.5mg/L+Cb100mg/L，在选二培养基GMS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+CH300mg/L+Km25mg/L+Cb50mg/L，在选二培养基中降低激素、杀菌抗生素含量和提高Km含量，有利于转化子的获得。通过分析影响遗传转化效率的因素，确立高效遗传转化体系，浸染时间5min，共培养时间3d，共培养培养基中去除CoCl·6HO，卡那霉素选择压为12.5～25mg/L。以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化长富2号苹果，通过25mg/L卡那霉素筛选和GUS检测，获得了转基因植株。通过RT-PCR检测间隔区序列和内源多酚氧化酶证明目的基因已经整合到苹果基因组中，并且有一定的干扰效果，通过荧光定量RT-PCR检测，结果显示转基因苹果植株内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69％以上，研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。

关键词：双链rnai PPO基因载体构建遗传转化苹果荧光定量RT-PCR

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苹果α-法尼烯合成酶基因表达载体的构建及遗传转化

苹果α-法尼烯合成酶基因表达载体的构建及遗传转化

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作者：吕慧贞山东农业大学

学位级别：硕士

虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一,这种生理病害不仅影响果实的食用品质特别是外观品质,降低其商品价值,而且使果实抗病性降低,易感染病菌而腐烂,从而造成巨大的经济损失。实验证明α-法尼烯是诱导虎皮病发... 详细信息

虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一,这种生理病害不仅影响果实的食用品质特别是外观品质,降低其商品价值,而且使果实抗病性降低,易感染病菌而腐烂,从而造成巨大的经济损失。实验证明α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素。果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,调控此途径的酶包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),法尼基焦磷酸合成酶(FPPS),α-法尼烯合成酶(AFS)。其中AFS是调控α-法尼烯合成的最直接的限速酶,它催化法尼基焦磷酸(FPP)转变为α-法尼烯。我们可以通过基因敲除方法调控此基因的表达,从而调控α-法尼烯的合成。根据α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,构建正义和rnai载体,转化烟草和苹果,研究α-法尼烯的表达情况;研究影响苹果离体叶片的再生因子,完善苹果再生体系;利用根癌农杆菌介导,转化苹果,筛选苹果新品种。主要结果如下: 1.利用RT-PCR方法,从苹果果皮中克隆苹果α-法尼烯合成酶基因(AFS)。 2.构建了pBI-AFS正义表达载体,并转化烟草,得到转AFS基因的烟草。 3.利用构建pET-AFS原核表达载体,转化大肠杆菌,制备抗体,western杂交结果显示该基因在烟草中成功表达。 4.构建α-法尼烯合成酶基因rnai表达载体,进行苹果的遗传转化。 5.通过研究基本培养基、激素配比、蔗糖浓度等对苹果离体叶片再生不定芽的影响,优化再生条件,完善苹果再生体系。 6.在建立高效的苹果再生体系基础上,研究了苹果转化过程中的影响因子,初步建立了苹果的遗传转化系统。

关键词：双链rnai AFS 载体构建离体再生遗传转化

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