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抗癌胚抗原(CEA)纳米抗体的筛选鉴定及双纳米抗体夹心elisa检测CEA

中国生物工程杂志 2024年第2期44卷 48-58页

作者：王新婷胡倩倩娄楚杨天宁李江伟新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046

目的:筛选能与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)高亲和力结合的纳米抗体(nanobodies,Nbs),用于今后开发CEA的快速检测方法。方法:使用人CEA蛋白免疫双峰驼,以淋巴细胞cDNA为模板,采用巢式PCR扩增重链抗体可变区(VHH)基因,连接到p... 详细信息

目的:筛选能与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)高亲和力结合的纳米抗体(nanobodies,Nbs),用于今后开发CEA的快速检测方法。方法:使用人CEA蛋白免疫双峰驼,以淋巴细胞cDNA为模板,采用巢式PCR扩增重链抗体可变区(VHH)基因,连接到pMECS载体,电转化TG1大肠杆菌,构建VHH cDNA文库。经辅助噬菌体M13K07感染后生成噬菌体展示文库,采用elisa固相亲和淘洗方法,富集与CEA结合的VHH克隆,通过胞间质可溶性elisa(PE-elisa)筛选与CEA高结合的纳米抗体,并在WK6中进行IPTG诱导表达和亲和纯化。elisa检测纳米抗体与CEA的结合特异性,竞争elisa筛选配对纳米抗体构建夹心elisa。结果:构建获得了库容为2.8×10^(8) cfu的VHH文库,菌液PCR表明VHH插入约为100%,随机挑取第2~3轮淘洗富集的90个克隆进行PE-elisa检测,结果45个克隆为阳性,序列分析表明,它们编码7个纳米抗体序列。在WK6中,这些纳米抗体以可溶形式表达,经Ni亲和层析获得了纯度接近90%的重组纳米抗体。间接elisa显示7株纳米抗体均特异结合CEA,其中2株纳米抗体3G2和3F4与CEA具有较高亲和力且呈浓度依赖,即使在高浓度(5μg/mL)下也不与无关蛋白溶菌酶结合,表现出较高特异性。竞争elisa结果显示,3G2和3F4在结合CEA中没有竞争作用,表明3G2和3F4结合在CEA的不同表位。将3F4作为捕获抗体,3G2作为检测抗体,建立了双纳米抗体夹心elisa方法(2Nbs-elisa法),其对溶液中CEA的检测限(limit of detection,LOD)为1.8 ng/mL。结论:采用获得的两株CEA特异纳米抗体建立了夹心elisa检测方法,对CEA的检测具有更高敏感性和特异性。

关键词： CEA 纳米抗体噬菌体展示表位归类双纳米抗体夹心elisa

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抗PEDV纳米抗体的制备及双抗体夹心elisa的建立

抗PEDV纳米抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

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作者：王毅河北科技师范学院

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(PED)是一种具有高度接触性的肠道传染病,易感动物属是猪源,尤其对仔猪危害性极大。利用噬菌体展示技术简便快捷筛选出特异性抗体的技术正逐步成熟。纳米抗体可有效抑制病毒感染,可作为PEDV治疗的潜在试剂,为PEDV的治疗和... 详细信息

猪流行性腹泻(PED)是一种具有高度接触性的肠道传染病,易感动物属是猪源,尤其对仔猪危害性极大。利用噬菌体展示技术简便快捷筛选出特异性抗体的技术正逐步成熟。纳米抗体可有效抑制病毒感染,可作为PEDV治疗的潜在试剂,为PEDV的治疗和预防提供了一定的参考,也对动物源病毒抗体筛选方面有较大的理论价值和广泛的市场应用前景。本研究筛选出5株针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,取3株结合效价较高的纳米抗体进行HRP标记,并初步建立了一种双纳米抗体夹心elisa方法,实验内容与结果如下:1.利用实验室保存的羊驼天然纳米抗体文库,通过四轮淘选-增扩-富集-测序,最终结果得到12株氨基酸序列不同的纳米抗体。首先经过原核直接诱导表达纳米抗体,经elisa、SDS-PAGE、Western Blot鉴定,结果发现有11株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的亲和力。2.根据上述实验结果获取的11株纳米抗体序列,设计带有同源臂的上下游引物,经同源重组方法将目的序列克隆至p CAGGS-h Ig H-Fc真核载体中进行表达纯化。经IFA、Western Blot、elisa结合实验鉴定,得到5株Nb均有良好的结合性和特异性。3.将高结合力的3株Nb进行HRP标记,以此建立双纳米抗体夹心elisa方法,结果为Nb-1和Nb-10分别是最佳捕获抗体和最佳检测抗体,最佳捕获抗体浓度为3μg/m L,最佳检测抗体比例是1:400,S/N为4.8;最佳封闭液反应时间是5%BSA、37℃孵育反应2 h为最优;最佳抗原的孵育条件为37℃,2h;最佳检测抗体反应条件为37℃,1 h;检测抗原限度为3.125 ng/m L;根据上述最优条件,进行批间批内重复性测定变异系数分别小于5%和10%;同等条件下,选取三种腹泻重组蛋白,与PEDV-S1蛋白按相同浓度同时孵育1 h后,进行吸光值测定,结果表示特异性良好;最后采用PEDV检验此方法的临床应用效果,随着病毒样本浓度的降低,吸光值也随之变低,为检验临床样本提供了一种可行的免疫分析方法。

关键词： PEDV S1蛋白噬菌体展示技术纳米抗体双纳米抗体夹心elisa

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