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作者：黎婕中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

背景肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,病情隐匿且易转移复发。我国每年新增确诊肝癌患者和因肝癌死亡人数都持续增加,远高于世界平均水平。目前肝癌治疗方法包括外科治疗、放射治疗、系统治疗等多种手段,其中以化疗药物为基础的系统治疗是肝... 详细信息

背景肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,病情隐匿且易转移复发。我国每年新增确诊肝癌患者和因肝癌死亡人数都持续增加,远高于世界平均水平。目前肝癌治疗方法包括外科治疗、放射治疗、系统治疗等多种手段,其中以化疗药物为基础的系统治疗是肝癌治疗中重要的手段,尤其是针对不能进行外科治疗的病人或者对于晚期肝癌病人。索拉非尼作为系统治疗中推荐使用的一线药物,增加患者生存获益的同时,其耐药问题也一直十分突出。因此,继续开发研制新的抗癌药物十分重要。相比于传统新药开发路线,“老药新用”有其不能比拟的优势——研发周期短、临床数据丰富、成本低等。双硫仑是美国食品和药品管理局批准用治疗酒精成瘾的药物,已广泛使用超过60年,具有完善的药代动力学、安全性和耐受性等多方面患者数据资料。近年来有文献报道,双硫仑体内代谢产物——CuET在临床和临床前研究中均展示良好的抗癌活性。但CuET在肝癌治疗中的研究很少,且肝脏是双硫仑的主要代谢器官,因此我们将对CuET对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其分子机制进行深入探讨,以期为双硫仑“老药新用”提供新的思路,同时也为CuET成为临床肝癌治疗药物提供理论与实验依据。目的阐明CuET抑制肝癌细胞HepG2、SMMC-7721增殖诱导凋亡的分子机制,以期为CuET成为临床肝癌治疗药物奠定基础。方法MTT比色法和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测ROS和细胞凋亡;Western Blot实验检测凋亡相关和线粒体分裂相关蛋白表达;激光共聚焦观察线粒体分裂和Drp1与线粒体共定位;透射电镜观察线粒体形态。内容与结果***抑制肝癌细胞增殖诱导凋亡MTT检测发现CuET可以抑制不同类型肿瘤细胞增殖,其中对肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721效果更明显(P<0.01),但对正常肝细胞THLE增殖没有影响(P<0.01)。软琼脂克隆形成实验也证实CuET对肝癌细胞增殖具有抑制作用(P<0.01)。流式细胞术和Western Blot检测表明,CuET可诱导肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721凋亡(P<0.01)并促进凋亡关键蛋白细胞色素C释放到胞浆,Caspase 3和Caspase 9剪切活化,PARP降解。***促进线粒体过度分裂诱导线粒体损伤透射电镜观察发现,CuET处理后,Hep G2和SMMC-7721细胞线粒体数量减少(P<0.01),且剩余线粒体出现肿胀、断裂和嵴扭曲变形。激光共聚焦显微镜观察发现,CuET处理后导致细胞线粒体发生过度分裂(P<0.01),断裂呈“点状”。***通过促进Drp1 Ser637位点去磷酸化、Drp1线粒体转位,引发线粒体过度分裂和细胞凋亡Western Blot检测发现CuET可导致Drp1 Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位,均呈现良好的剂量和时间依赖性,但对Drp1 Ser616位点磷酸化水平无明显影响。紧接着,采用Drp1线粒体转位抑制剂Mdivi-1预处理细胞,预处理后可明显阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,减少细胞凋亡(P<0.01)。通过sh RNA技术敲降Drp1,发现敲降Drp1蛋白后,肝癌细胞线粒体不再过度分裂(P<0.01),分裂融合重新恢复平衡,细胞凋亡明显减少(P<0.01);通过点突变技术,构建Drp1 637A、Drp1 637D质粒分别模拟Drp1 637位点去磷酸化状态和磷酸化状态,发现转染Drp1 637D质粒在恢复Drp1Ser637位点磷酸化水平的同时,也直接阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,避免了线粒体分裂-融合平衡遭到破坏,极大地减少了CuET引起的细胞凋亡(P<0.01);而转染Drp1 637A质粒效果与之相反,不仅加剧Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位的程度,而且进一步导致线粒体损伤断裂,促进CuET诱导的细胞凋亡(P<0.01)。***通过增加肝癌细胞线粒体超氧型ROS水平,促进Drp1 Ser637位点去磷酸化和Drp1线粒体转位,进而导致线粒体分裂和细胞凋亡流式细胞术检测发现,CuET可导致肝癌细胞内ROS水平上升(P<0.01),且ROS为超氧阴离子(O)型ROS,主要来自于线粒体。采用线粒体超氧阴离子清除剂Mito Q预处理细胞,预处理后直接阻断CuET引起的线粒体内O水平升高(P<0.01),恢复Drp1 Ser637位点磷酸化水平,同时抑制Drp1线粒体转位,进而维持线粒体分裂-融合平衡,减少CuET引起的细胞凋亡(P<0.01)。结论CuET诱导肝癌细胞线粒体分裂和细胞凋亡。CuET刺激肝癌细胞线粒体内超氧型ROS水平升高,促使Drp1 Ser637位点去磷酸化,继而解除对Drp1线粒体转位的抑制,促进其大量转位至线粒体;转位后,破坏线粒体分裂-融合平衡,导致线粒体分裂加

关键词：双硫仑/铜复合物肝癌 Drp1 ROS 线粒体分裂细胞凋亡

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双硫仑/铜复合物联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

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中华实验外科杂志 2024年第8期41卷 1725-1729页

作者：张弓李素新郭化虎李路豪李林刘兆臣郑州大学第一附属医院肝胆胰外科郑州450052

目的检测双硫仑/铜复合物(DSF/Cu)联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法以浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009μmol/L的多柔比星及相同浓度梯度的DSF/Cu(Cu2+... 详细信息

目的检测双硫仑/铜复合物(DSF/Cu)联合多柔比星对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法以浓度5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009μmol/L的多柔比星及相同浓度梯度的DSF/Cu(Cu2+固定浓度1μmol/L)分别处理HepG2细胞,噻唑蓝(MTT)法计算多柔比星和DSF/Cu对HepG2细胞的半抑制浓度(IC50)。以上述浓度梯度的多柔比星单独及联合0.15μmol/L的DSF/Cu处理HepG2细胞,MTT法分析单用多柔比星及联合DSF/Cu对HepG2细胞增殖的影响,CompuSyn软件计算两药作用的联合指数(CI)。将HepG2肝癌细胞分为未处理组(不添加任何药物)、二甲基亚砜(DMSO)处理组(仅加入与DSF/Cu处理组等量的DMSO)、DSF/Cu处理组(IC50浓度的DSF/Cu处理)、多柔比星处理组(IC50浓度的多柔比星处理)、多柔比星+DSF/Cu处理组(IC50浓度的多柔比星及DSF/Cu联合处理),以流式细胞技术检测各组HepG2肝癌细胞中ALDH+细胞数量的改变,干细胞成球实验检测各组HepG2肝癌细胞成瘤性的改变,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组HepG2肝癌细胞中人表皮生长因子受体2(Her-2)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)蛋白的表达。组间两两比较采用配对样本t检验,组间多个均数比较采用单因素方差分析。结果多柔比星和DSF/Cu对HepG2肝癌细胞作用48 h的IC50分别为0.8698、0.5538μmol/L。多柔比星联合0.15μmol/L的DSF/Cu对HepG2肝癌细胞的增殖抑制作用明显强于单用多柔比星(t=8.930,P0.05)。Western blot结果显示,DSF/Cu处理组和多柔比星+DSF/Cu处理组HepG2肝癌细胞中Her-2、SOX9、c-Myc蛋白的表达低于未处理组(0.132±0.013比0.049±0.010比0.950±0.052、0.325±0.049比0.311±0.038比0.922±0.027、0.308±0.041比0.235±0.027比0.816±0.092,F=412.50、113.20、47.54,P<0.05),而LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白表达高于未处理组(1.527±0.201比2.629±0.224比0.766±0.159、0.906±0.083比0.834±0.058比0.039±0.001,F=35.15、170.40,P<0.05)。多柔比星处理组HepG2肝癌细胞中Her-2和SOX9蛋白的表达低于未处理组(0.275±0.018比0.950±0.052、0.535±0.034比0.922±0.027,t=17.440、12.680,P<0.05),但c-Myc、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Cleaved PARP蛋白的表达与未处理组比较差异无统计学意义(0.914±0.097比0.816±0.092、1.329±0.152比0.766±0.159、0.063±0.017比0.039±0.001,t=1.042

关键词：双硫仑/铜复合物多柔比星肝癌增殖凋亡

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