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双特异性纳米抗体的设计制备及其在血液净化中的应用

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双特异性纳米抗体的设计制备及其在血液净化中的应用

作者：王耀辉大连理工大学

学位级别：硕士

血液净化是一种通过膜分离或者吸附作用清除患者血液中内源、外源性毒素的临床治疗手段,对于急性中毒、器官衰竭等危重症患者可有效缓解症状,具有良好的治疗效果。近年来重症医学领域研究表明,白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-... 详细信息

血液净化是一种通过膜分离或者吸附作用清除患者血液中内源、外源性毒素的临床治疗手段,对于急性中毒、器官衰竭等危重症患者可有效缓解症状,具有良好的治疗效果。近年来重症医学领域研究表明,白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为典型的促炎细胞因子,在“细胞因子风暴”的发生、发展过程中扮演了重要角色,而这种过激的炎症反应是导致癌症免疫治疗、新冠肺炎、细菌感染患者病情恶化的关键因素。因此,通过血液净化技术快速、高效清除患者血液循环中的IL-6和TNF-α在重症医学领域具有重要价值。针对现有技术在临床使用中表现出的目标选择性差、效率低等问题,本论文发展了一种基于双特异性抗体的特异性血液净化吸附材料。该技术策略基于抗原-抗体的亲和识别作用,将能够分别识别IL-6和TNF-α的驼科单链抗体片段(也被称为纳米抗体)进行串联表达,获得了能够同时识别上述两种抗原的双特异性抗体,并以此为亲和配基制备了高选择性吸附材料,进一步验证了该材料在血浆体系对目标物的吸附效果。具体结果如下:(1)单价纳米抗体及IL-6的制备。利用基因重组表达技术,通过原核表达的方式制备了anti-IL-6纳米抗体和anti-TNF-α纳米抗体,其结合抗原的平衡解离常数分别为2.1×10M和3.5×10M。并通过原核表达及稀释复性技术制备了具有活性的人IL-6,复性率为21%。(2)单特异性吸附剂制备及其性能评价。以制备的单价纳米抗体为功能基,以琼脂糖凝胶微球为基质通过氨基偶联分别制备了IL-6特异性吸附剂和TNF-α特异性吸附剂。吸附评价实验结果表明,两种吸附剂均可有效结合目标抗原。IL-6吸附剂的饱和吸附容量为7.45 mg/m L,在模拟血液条件下对IL-6的去除率最高可达96%。TNF-α吸附剂饱和吸附容量为2.22 mg/m L,其对TNF-α的去除率达到86%。(3)双特异性纳米抗体的表达及吸附剂的制备评价。通过原核串联表达的方式制备双特异性纳米抗体。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、Biacore分子间相互作用分析仪和液相色谱对双特异性纳米抗体的抗原结合特性进行了表征。结果表明,所制备的双特异性纳米抗体对IL-6和TNF-α的平衡解离常数分别为1.7×10M和3.7×10M,与单价抗体相当。双特异性抗体可同时结合两种抗原,互不影响。该双特异性抗体经共价固载制备的吸附材料对IL-6和TNF-α的饱和容量分别为6.9 mg/m L和2.19mg/m L。动态吸附结果证明吸附剂对IL-6的去除率最高为97%,对TNF-α的去除率不低于84%。综上,本论文成功以双特异性纳米抗体为亲和配基制备了一种高选择性血液净化吸附剂,可实现在复杂的血浆体系中识别并吸附去除IL-6和TNF-α。该血液净化吸附材料有望在细胞因子风暴的干预治疗中发挥作用。

关键词：双特异性纳米抗体细胞因子血液净化特异性吸附剂

双特异性纳米抗体anti-HER2＆VEGFR2的制备及其在结直肠癌中的作用

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双特异性纳米抗体anti-HER2＆VEGFR2的制备及其在结直肠癌中的作用

作者：葛秋寒大理大学

学位级别：硕士

目的:针对肿瘤的化疗和放疗传统疗法靶向性差的缺点,本研究构建一种新型的双特异性纳米抗体HER2和VEGFR2,以更好的为肿瘤患者提供有效的治疗策略。方法:在大肠杆菌BL21（DE3）中表达目的蛋白;用渗透压休克法提取周质蛋白;通过镍柱纯化... 详细信息

目的:针对肿瘤的化疗和放疗传统疗法靶向性差的缺点,本研究构建一种新型的双特异性纳米抗体HER2和VEGFR2,以更好的为肿瘤患者提供有效的治疗策略。方法:在大肠杆菌BL21（DE3）中表达目的蛋白;用渗透压休克法提取周质蛋白;通过镍柱纯化目的蛋白;采用流式细胞术分析纳米抗体与结直肠癌表面抗原的结合能力;运用表面离子共振技术SPR检测纳米抗体和抗原之间的亲和力情况;在体外实验中,利用CCK8试剂盒验证纳米抗体抑制肿瘤细胞增殖的能力,用Graphpad Prism软件计算IC50值;采用细胞凋亡试剂盒分析纳米抗体诱导细胞凋亡的能力,用Mod Fit LT软件对细胞凋亡进行相对定量分析。结果:在大肠杆菌成功的表达了目的蛋白,2D3和3VGR19-3的分子量大小为15KDa;2D3+3VGR19-3的分子量大小为28KDa;用SPR法检测了抗体和抗原两者之间的解离常数,双特异性纳米抗体分别与抗原HER2和抗原VEGFR2结合的KD值为2.838E-9M和3.132E-9M;在CCK8实验中,纳米抗体能够呈剂量依赖性的抑制肿瘤的生长,在细胞凋亡实验中,我们所构建的纳米抗体能诱导细胞凋亡,双特异性纳米抗体使HT29细胞的凋亡率从6.5%（早期凋亡3.75%+晚期凋亡2.93%）显著增加到约55%。结论:我们构建的纳米抗体显示了有效的生物学功能,双特异性纳米抗体比单个纳米抗体的抗癌活性更强,根据以上实验的分析,通过阻断双靶点通路（HER2/VEGFR2）发挥的抗肿瘤效果高于单靶点通路。

关键词：双特异性纳米抗体结直肠癌表皮生长因子受体2 血管内皮生长因子受体2

基于Snoopligase制备抗TNFα和IL17A双特异性纳米抗体及其应用研究

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基于Snoopligase制备抗TNFα和IL17A双特异性纳米抗体及其应用研究

作者：赵伟大连理工大学

学位级别：硕士

炎症性疾病严重威胁人类健康,其中类风湿性关节炎作为最常见的全身性自身免疫性疾病之一,发病率在0.5%-1%。研究表明,以肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor,TNFα）为靶点的单克隆抗体药物在治疗上有局限性,白介素17A（Interleukin ... 详细信息

炎症性疾病严重威胁人类健康,其中类风湿性关节炎作为最常见的全身性自身免疫性疾病之一,发病率在0.5%-1%。研究表明,以肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor,TNFα）为靶点的单克隆抗体药物在治疗上有局限性,白介素17A（Interleukin 17A,IL17A）为补充靶点的双特异性抗体药物有希望弥补单一靶点药性不足的问题。一直以来,对双特异性抗体的研究从未停止,通过基因工程串联两个抗体基因并表达,制备C-N连接方式的双特异性抗体,会干扰其对抗原的结合活性。酶催化如转肽酶或谷氨酰胺转移酶可用于蛋白质的表达后偶联,制备的双特异性抗体可能存在均质性差等问题。纳米抗体具有良好的稳定性、抗原结合活性,且以纳米抗体作为亲和配基的免疫吸附材料的出现,更为炎症性疾病的治疗提供了一种新的思路。本论文报道一种一锅法制备和固载双特异性纳米抗体的方法:基于Snoopligase与底物稳定结合的性质,将Snoopligase固载至双环氧活化的琼脂糖凝胶上,与加有反应标签的抗TNFα和IL17A的纳米抗体反应,制备免疫吸附剂,并评价其在溶液环境中吸附抗原的能力,此外通过对载体洗脱可制备游离的双特异性纳米抗体（Bis-Nb）,并对其进行评价。具体研究内容如下:（1）大肠杆菌发酵表达蛋白质MBP-Snoop Tag Jr、e GFP-Dog Tag、Nb TNFα-Dog Tag、Nb IL17A-Snoop Tag Jr和Snoopligase。经镍柱纯化后纯度均在90%以上。使用模式体系对Snoopligase反应验证,并优化反应的p H、甘油浓度、反应温度、反应时间,发现在p H为8.25并含有30%甘油的三乙醇胺（TEAM）溶液,于4℃下孵育反应20 h,可得到70%的产物生成。（2）双环氧活化的琼脂糖凝胶CL6B环氧密度为40μM/m L胶,Snoopligase的固载量为28.6 mg/m L胶。且相较于第一次,固定化Snoopligase在10次重复使用中均表现出90%产物的生成。使用p H 1.5甘氨酸盐酸对非均相反应后载体洗脱,准确制备了纯度在90%以上,具有抗原结合活性且可同时结合两个抗原,亲和力与单独纳米抗体相当的Bis-Nb,其可以有效地抑制因炎症因子TNFα和IL17A引起的类风湿性关节炎患者关节处成纤维细胞（RA-FLS）的异常增殖与迁移。（3）对双特异性纳米抗体免疫吸附剂稳定性评价表明,在温和的溶液环境条件下,吸附剂的配基不会脱落,且其可以在含0.02%叠氮钠的PBS溶液中稳定保存13天。在PBS溶液环境下的标准静态吸附评价表明,免疫吸附剂对抗原TNFα的饱和吸附量为2.3mg/m L,对IL17A的饱和吸附量为2.1 mg/m L。综上所述,本论文提供了一种基于Snoopligase制备双特异性纳米抗体及双特异性免疫吸附剂的方法,为双特异性蛋白质的制备以及Snoopligase的应用提供了一种新的策略。相信本论文中制备的双特异性纳米抗体及吸附剂对由炎症子引起的疾病有良好的治疗潜力。

关键词： Snoopligase 双特异性纳米抗体 IL17A TNFα 免疫吸附剂

一种靶向EGFR二聚化界面的人源化双特异性纳米抗体

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一种靶向EGFR二聚化界面的人源化双特异性纳米抗体

作者：温碧燕广东药科大学

学位级别：硕士

目的与意义:表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）是人表皮受体（Human Epidermal Receptor,HER）或Erb B家族的成员之一,也是酪氨酸激酶受体超级家族的一员,目前已成为多类恶性肿瘤（胃癌、非小细胞肺癌、乳腺... 详细信息

目的与意义:表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）是人表皮受体（Human Epidermal Receptor,HER）或Erb B家族的成员之一,也是酪氨酸激酶受体超级家族的一员,目前已成为多类恶性肿瘤（胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌和结直肠癌等）治疗的热门靶点之一。针对受体分子胞外域的单克隆抗体和胞内域的小分子酪氨酸激酶抑制剂是目前抗HER治疗的主要靶向药物类型,但已上市药物普遍存在临床反应率低、耐药性等问题。HER家族受体分子表面和胞内域广泛存在的遗传性、病理性突变以及家族受体间的异源二聚化是该类靶向治疗药物获得性耐药的二个主要原因,而靶向结构上高度保守、并直接参与受体二聚化的EGFR二聚化界面则有可能解决抗EGFR治疗的耐药问题。本实验室前期研究曾采用来自EGFR二聚化界面直接参与二聚化的β-环多肽EGFR237-267做抗原,构建或筛选了靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗、单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）和纳米抗体（nanobody）,并通过体内外抑瘤实验初步证明了EGFR二聚化界面靶向策略的可行性。纳米抗体（nanobody）亦称单域抗体（single domain antibody,sd Ab）或重链单域抗体（variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH）,来自羊驼和鲨鱼的重链抗体的可变区,分子量约15 k Da,具有良好的理化稳定性和组织穿透能力,可以利用微生物基因工程系统高效生产,在研制廉价高效的治疗性抗体和检验试剂方面具有良好的应用前景,但其血清稳定性远不如单抗,体内半衰期短,另外也不具备单抗那样的ADCC作用（抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）。目标纳米抗体与抗人白蛋白的纳米抗体偶联后可在体内与人血白蛋白（human serum albumin,HSA）结合而受到白蛋白的保护,提高半衰期,而靶向自然杀伤细胞（natural killer,NK）表面的Fc受体FcγRIIIa（CD16）的纳米抗体则可赋予纳米抗体的ADCC作用。本研究拟构建一类具有较高血清稳定性的、既具有抗EGFR二聚化功能又具备ADCC作用的、由靶向EGFR二聚体界面、NK细胞Fc受体FcγRIIIa（CD16）和HSA三种纳米抗体组成的纳米抗体,并系统考察其体外血清学稳定性和体外体内的抑瘤活性。为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性纳米抗体药物打下坚实基础。纯化产物以人表皮癌A431细胞和人肺癌NCI-H292细胞为靶细胞,采用流式细胞术分析双特异性抗体与细胞表面EGFR的特异性结合能力,证实双特异性抗体对过表达EGFR细胞是否呈剂量依赖性结合效果。观察双特异性抗体单独用药和与PBMCs联用对EGFR阳性肿瘤细胞的杀伤作用,同时与单一纳米抗体进行比对,验证双特异性抗体是否对肿瘤细胞存在细胞毒效应。以人表皮癌A431细胞为移植瘤细胞,进行裸鼠荷瘤实验,验证双特异性抗体与对照单一纳米抗体在体内的肿瘤杀伤作用;免疫组化法检测双特异性抗体与对照的单一纳米抗体在体内的定向穿透肿瘤组织能力,验证双特异性抗体的组织穿透能力。为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性抗体打下基础。研究内容与方法:1.双特异性纳米抗体的构建、表达与纯化1.1抗体设计双特异性抗体（TSsd Ab）采取sd Ab EGFR-（G4S）3-sd Ab HSA-（G4S）3-sd Ab FcγRIIIa-His6模式,其中sd Ab EGFR为本实验室从一种非免疫人源化纳米抗体噬菌体展示库筛选到的靶向EGFR二聚体界面的纳米抗体,即上述EGFR dimer Nb77;sd Ab HSA和sd Ab FcγRIIIa分别为文献报道的抗人白蛋白和抗FcγRIIIa的纳米抗体;（G4S）3为柔性接头,为3个串联重复的Gly-Gly-Gly-Ser序列;His6为亲和层析标签,为6个His连续序列。1.2表达系统构建与小规模制备通过基因工程手段获取目的基因表达载体,用限制性内切酶Xho I、Xba I酶将扩增的目的基因与提取的质粒进行双酶切、连接,组合质粒转移到毕赤酵母X-33,SDS-PAGE和Western blot技术对毕赤酵母X-33工程菌的表达产物进行分析,用CM Sepharose column、Ni-NTA column亲和层析纯化。采用人工合成法获得目的基因,采用毕赤酵母-X33分泌型表达系统构建工程菌,表达载体为p GAPzαA,为GAP启动子驱动的组成型分泌表达载体,目的基因按毕赤酵母偏爱密码子设计、并与

关键词：表皮生长因子受体二聚体界面双特异性纳米抗体耐药性肿瘤

抗EGFR与抗VEGFR2双特异性纳米抗体的制备及其体外生物活性检测

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抗EGFR与抗VEGFR2双特异性纳米抗体的制备及其体外生物活性检测

作者：孙天元大理大学

学位级别：硕士

目的:针对单克隆抗体存在的亲和力差、免疫原性强、非特异性及毒性等缺陷,本研究将研发可同时结合VEGFR2和EGFR且具有生物学活性的双特异性纳米抗体,以期为纳米抗体在肿瘤治疗方面提供新的研究方向。方法:大肠杆菌中表达目的蛋白;镍离... 详细信息

目的:针对单克隆抗体存在的亲和力差、免疫原性强、非特异性及毒性等缺陷,本研究将研发可同时结合VEGFR2和EGFR且具有生物学活性的双特异性纳米抗体,以期为纳米抗体在肿瘤治疗方面提供新的研究方向。方法:大肠杆菌中表达目的蛋白;镍离子金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白;采用FACS法分析双特异性纳米抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合情况;运用SPR技术定量检测纳米抗体分别与抗原EGFR和VEGFR2的结合情况;利用CCK-8试剂盒考察纳米抗体对细胞生长的抑制能力,用Graphpad Prism软件拟合曲线计算IC50值和EC50值;采用细胞划痕实验分析纳米抗体对细胞迁移能力的影响,并用Image-J软件灰度扫描计算细胞愈合率;免疫印迹法分析信号通路中磷酸化蛋白表达的情况,并用Image-J软件进行灰度扫描。结果:质粒在大肠杆菌中成功表达;经镍柱纯化得到目的蛋白,双特异性纳米抗体产量达到2 mg/L;纳米抗体可以与HT-29细胞中的抗原VEGFR2和EGFR结合;用SPR技术计算得到抗EGFR纳米抗体与抗原EGFR结合的K值为1.53E-8 M,抗VEGFR2纳米抗体与抗原VEGFR2结合的K值为2.138E-9 M,双特异性纳米抗体分别与抗原EGFR和抗原VEGFR2结合的K值为5.865E-7 M和6.666E-9 M;在CCK-8实验中,生长因子EGF刺激HT-29细胞的生长,EC50值为45.2 ng/m L,生长因子VEGF的EC50值为39.1 ng/m L,抗EGFR纳米抗体抑制HT-29细胞生长的IC50值为165.6 n M,抗VEGFR2纳米抗体的IC50值为514.9 n M,双特异性纳米抗体的IC50值为9.3 n M,而西妥昔单抗的IC50值为172.5 n M;在细胞划痕实验中,阴性对照组细胞愈合率为55.45%,抗EGFR纳米抗体组、抗VEGFR2纳米抗体组和双特异性纳米抗体组分别为14.42%、8.99%和6.84%;在免疫印迹法实验中,双特异性纳米抗体作用于细胞后,信号通路中磷酸化的蛋白呈剂量依赖性减少。结论:与单靶点纳米抗体相比,双特异性纳米抗体抑制肿瘤细胞生长作用更显著,表明Bi-Nb可以同时抑制不同信号通路,以增强对肿瘤细胞杀伤能力,为双特异性纳米抗体提供新的思路,使纳米抗体在恶性肿瘤的靶向治疗中显现出更广阔的应用前景。

关键词：血管内皮生长因子受体2 上皮生长因子受体双特异性纳米抗体结直肠癌

HER-2双特异性纳米抗体的筛选及功能鉴定

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HER-2双特异性纳米抗体的筛选及功能鉴定

作者：贾羽北京化工大学

学位级别：硕士

本研究构建了一种针对人表皮生长因子受体-2(HER-2,human epidermal growth factor receptor-2)的双特异性纳米抗体(BsNb,bispecific nanobody)。通过噬菌体库筛选出7个针对HER-2的纳米抗体的不同序列。将这7个序列分别连入pET-28a高表... 详细信息

本研究构建了一种针对人表皮生长因子受体-2(HER-2,human epidermal growth factor receptor-2)的双特异性纳米抗体(BsNb,bispecific nanobody)。通过噬菌体库筛选出7个针对HER-2的纳米抗体的不同序列。将这7个序列分别连入pET-28a高表达系统进行诱导表达,通过镍柱-中高压蛋白层析系统纯化蛋白。将纯化后的蛋白进行抗原-抗体和抗体-靶细胞的结合鉴定。鉴定完毕后,挑选出两个结合活性最好的纳米抗体,将相应片段分别与pFUSE-CH,CL载体构建人源化抗体表达质粒。经细胞表达产生完整IgG形式的双表位的抗体,之后进行细胞杀伤实验。筛选出特异性较强的纳米抗体片段;成功构建pET28a-BL21可溶性蛋白高效表达菌株;构建人源化抗体表达载体,获得的双特异性纳米抗体杀伤效果明显。构建的人源化的HER-2纳米双抗,对于肿瘤细胞的亲和和杀伤效果显著。相较于其他类别的人源化抗体,人源化的纳米双抗无论在成本还是亲和力方面都是不错的选择。如果能够产业化,将具有良好的应用前景。

关键词： HER-2 双特异性纳米抗体功能鉴定

基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立

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江苏农业学报 2024年第3期40卷 514-521页

作者：杨利张浩明乔绪稳陈瑾郑其升程海卫江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMD... 详细信息

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。

关键词：口蹄疫病毒双特异性纳米抗体血凝检测法