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作者：时宁中南大学

学位级别：硕士

研究背景:近年来,以PD-1/PD-L1(程序性死亡受体1/程序性死亡配体1)为靶点的抗体药物在临床上取得了巨大的突破,被誉为有史以来最成功的“广谱抗癌”药物靶点。但是,PD-1抗体单药治疗效果有限,原发性耐药和继发性耐药的人群仍然占有非常... 详细信息

研究背景:近年来,以PD-1/PD-L1(程序性死亡受体1/程序性死亡配体1)为靶点的抗体药物在临床上取得了巨大的突破,被誉为有史以来最成功的“广谱抗癌”药物靶点。但是,PD-1抗体单药治疗效果有限,原发性耐药和继发性耐药的人群仍然占有非常大的比例。可以预测,未来以研制PD-1抗体为主的双靶标、多靶标联合治疗或者双功能抗体药物将成为肿瘤治疗的发展方向。临床研究表明,在一些PD-1抑制剂耐药的肿瘤患者中,还存在其它免疫检查点的过表达。其中,LAG-3(淋巴细胞活化基因3)是重要的免疫检查点分子之一,在临床上已经证实LAG-3抗体与PD-1抗体联合使用具有协同的抗肿瘤作用。因此,我们利用我室自主研发的PD-1、LAG-3单克隆抗体开展“杵臼结构”的PD-1、LAG-3双功能抗体YG-003D3的设计及其抗肿瘤活性研究。研究目的:深入研究双功能抗体YG-003D3与亲本单克隆抗体单药以及联合治疗相比的优势和药理学特性,为YG-003D3(抗PD-1、LAG-3双功能抗体)的临床应用提供实验基础。研究方法:(1)YG-003D3双功能抗体制备及稳定性分析。利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)真核表达系统表达双功能的“Knob”(杵)和“Hole”(臼)蛋白,经过Protein A亲和层析柱纯化,在还原型谷胱甘肽的作用下进行体外组装,利用尺寸排阻色谱(SEC)及疏水色谱(HIC)分析组装后双抗轻重链正确配对的比例和蛋白纯度,使用Uncle高通量多参数蛋白稳定性分析仪分析YG-003D3的稳定性。均相时间分辨荧光技术(HTRF)检测YG-003D3 Fc相关的生物学活性。(2)体外检测YG-003D3与其配体PD-1/LAG-3结合活性。利用双抗原夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)检测YG-003D3同时与PD-1/LAG-3双靶标结合情况。生物膜层干涉技术(BLI)/流式细胞术分析双功能抗体YG-003D3在分子/细胞水平上与其配体PD-1/LAG-3的亲和力,利用BLI方法检测YG-003D3同时与PD-1/LAG-3两个分子结合是否存在位阻效应。利用流式细胞数检测YG-003D3与h PBMCs(人外周血单个核细胞)的结合能力。(3)体外检测YG-003D3是否可以阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、LAG-3/MHC-II结合。利用竞争ELISA检测YG-003D3对PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2结合的阻断效应,流式细胞术检测YG-003D3在细胞水平上对PD-1/PD-L1、LAG-3/MHC-II的阻断效应。(4)YG-003D3的体内抗肿瘤机制研究。流式细胞术检测YG-003D3是否能够桥连分别表达PD-1和LAG-3的细胞。h PBMCs激活实验及混合淋巴细胞反应(MLR)实验分析YG-003D3对h PBMCs细胞/CD4T细胞的激活效果。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒测定YG-003D3诱导h PBMCs对肿瘤细胞的体外杀伤能力。(5)利用PD-1/LAG-3双敲入转基因小鼠皮下接种MC38-h PD-L1肿瘤细胞,建立PD-1/LAG-3双人源化MC38-h PD-L1移植瘤模型,研究YG-003D3的抗肿瘤效果和分子机制。研究结果:在本研究中,我们成功构建了一种Fc失活的新型PD-1/LAG-3双功能抗体YG-003D3,其Fc不能与CD16a结合,但能与新生儿受体(Fc Rn)有效结合。研究证实,YG-003D3与亲本抗体保持相似的亲和力和热稳定性,并且双功能抗体Fv区在双靶标识别过程中相互独立,无空间位阻。YG-003D3不仅可以同时靶向单细胞上的PD-1/LAG-3,还可以桥连表达PD-1和LAG-3的两种细胞。特别是在h PBMCs活化实验中,与亲本PD-1抗体、LAG-3抗体甚至亲本抗体联合相比,YG-003D3能诱导更强的IFN-γ、IL-6和TNF-a分泌。同样,MLR实验也证实了YG-003D3相对抗PD-1、抗LAG-3抗体及亲本抗体联合具有更强的T细胞激活能力。在h PBMCs体外肿瘤杀伤实验中,YG-003D3激活h PBMCs杀伤肿瘤细胞的能力也优于抗PD-1或抗LAG-3抗体甚至亲本抗体联合组,杀伤率高达20%,抗PD-1、抗LAG-3抗体及其亲本抗体联合组杀伤率分别为7.8%、6.2%及12.8%。在人源化PD-1/LAG-3转基因小鼠皮下荷瘤模型中,YG-003D3表现出优于亲本抗体及其联合组的抗肿瘤活性。进一步研究表明,YG-003D3能够显著改善肿瘤微环境中免疫细胞的比例(特别是肿瘤组织中CD4T、CD3T、CD8T细胞比例以及外周血中CD3T、CD8T、CD4T细胞比例)。上述结果表明,YG-003D3可以更有效地激活机体抗肿瘤免疫反应发挥强大的抗肿瘤作用。结论:在本研究中,我们制备了一种靶向PD-1/LAG-3的双功能抗体YG-003D3。YG-

关键词： PD-1 LAG-3 双功能抗体肿瘤

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双功能抗体抗CD3／抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用

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中国癌症杂志 2011年第1期21卷 6-11页

作者：范冬梅李崴杨铭赵英新许元富陈礼平王敏中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 天津医科大学附属肿瘤医院头颈外科天津300060

背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用。本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用。方法... 详细信息

背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用。本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用。方法:利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞。首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度分组,以PBS、抗CD3scFv+、抗CD3scFv抗体及非相关抗体抗CD3/抗PGP为对照,另设CD19-K562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25∶1,抗体浓度500 ng/mL各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2的量,Real-time PCR法检测T细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α激活后的表达变化。结果:体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显增强(P双功能抗体抗CD3/抗CD19在体外介导T细胞对靶细胞具有较强的杀伤作用。

关键词：双功能抗体 CD3 CD19 淋巴瘤免疫治疗

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双功能抗体制备及其在导向治疗中的应用

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免疫学杂志 1993年第4期9卷 271-274页

作者：刘明旭车事医学科学院基础医学研究所

引言双功能抗体(bifunctional antibodies,BFA),即双特异抗体(bispecific antibodies),指可以与两种抗原结合的抗体;根据结构和制备方法不同分三类:第一类是双特异性单抗(bispecific monoclonal antibodies,bsMcAb),为二次杂交瘤(hybridhybridoma)分泌;第二类是两种抗体的Fab’氧化形成的杂合(Fab’)_2;第三类是两种抗体或其(Fab’)_2共价交联而成的。BFA最初用于组化研究和免疫分析,不久就用作导向药物,把毒素或效应细胞导向到靶细胞上。

关键词：双功能抗体导向疗法

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双功能抗体介导结肠癌细胞杀伤效应的研究

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中国肿瘤临床 2003年第3期30卷 214-216页

作者：高学硕万文徽张宏北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所北京肿瘤医院检验科北京市100036

目的:研究抗CD3/抗TNP双功能抗体与TNP化抗癌胚抗原(CEA)McAb结合,在裸鼠体内对结肠癌细胞的杀伤作用。方法:将抗癌胚抗原单抗TNP化,TNP化后的抗CEA单抗(TNP-CEA)、抗CD3/抗TNP双功能抗体、人淋巴细胞及结肠癌细胞CL187接种于裸鼠体内,... 详细信息

目的:研究抗CD3/抗TNP双功能抗体与TNP化抗癌胚抗原(CEA)McAb结合,在裸鼠体内对结肠癌细胞的杀伤作用。方法:将抗癌胚抗原单抗TNP化,TNP化后的抗CEA单抗(TNP-CEA)、抗CD3/抗TNP双功能抗体、人淋巴细胞及结肠癌细胞CL187接种于裸鼠体内,计算肿瘤生长体积,观察成瘤率。结果:双功能抗体能够介导PBLs对CL187细胞的杀伤作用。结肠癌细胞CL187的成瘤能力受到抑制,成瘤率为0/4。结论:此双功能抗体在免疫治疗中具有潜在的应用价值。

关键词：结肠肿瘤细胞系双功能抗体三硝基苯

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双功能抗体联合阿糖胞苷介导T细胞对白血病细胞系Nalm-6的细胞毒作用

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肿瘤防治研究 2014年第8期41卷 866-870页

作者：李崴王东高子璐金锐天津医科大学附属肿瘤医院颌面耳鼻喉头颈外科国家肿瘤临床医学中心天津市"肿瘤防治"重点实验室天津300060

目的研究阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-C)对人白血病细胞系Nalm-6共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)表达的影响,以及联合双功能抗体介导T细胞对Nalm-6体外杀伤作用。方法 MTT法测定Ara-C对Nalm-6细胞的细胞毒作用,FACS测定一定浓... 详细信息

目的研究阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-C)对人白血病细胞系Nalm-6共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)表达的影响,以及联合双功能抗体介导T细胞对Nalm-6体外杀伤作用。方法 MTT法测定Ara-C对Nalm-6细胞的细胞毒作用,FACS测定一定浓度阿糖胞苷作用Nalm-6细胞后CD80和CD86的表达变化,利用非放射性荧光法测定双功能抗体体外介导T细胞对靶细胞的杀伤效果,FACS和ELISA法分别测定活化的T细胞表达CD25、CD69和分泌IL-2的变化。结果 Ara-C作用Nalm-6细胞的IC10为0.25μM,Nalm-6细胞经Ara-C刺激后CD80的表达明显高于对照组,在一定的效靶比范围内,随着效靶比的升高,双功能抗体介导T淋巴细胞对Nalm-6细胞的杀伤率也随之提高,联合Ara-C后效果最显著。T细胞活化的表面标记CD25、CD69表达显著上调,IL-2的释放较对照组明显升高。结论 Ara-C可上调人白血病细胞系Nalm-6 CD80的表达,从而增强双功能抗体介导的T细胞对靶细胞的体外杀伤作用,更有效地活化T细胞。

关键词：阿糖胞苷白血病双功能抗体 B7分子 T淋巴细胞

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抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

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生物化学与生物物理进展 1997年第5期24卷 454-458页

作者：高荣凯王琰刘群英化冰朱迎春陈宇萍海军总医院中心实验室北京100037

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体 ,用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因 ,通过酶切分析和DNA序列测定核实后 ,将其重组到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)Fab段的Fd羧基端 ,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP ,转化大肠杆菌XL1 Blu... 详细信息

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体 ,用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因 ,通过酶切分析和DNA序列测定核实后 ,将其重组到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)Fab段的Fd羧基端 ,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷诱导表达后 ,采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性 ,显示抗HBsAg 碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达 .

关键词：乙型肝炎表面抗原碱性磷酸酶双功能抗体制备

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抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的构建和表达

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生物工程学报 2003年第4期19卷 444-449页

作者：高瀛岱熊冬生许元富彭晖邵晓枫杨纯正朱祯平中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

构建和表达抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并测定该微型双功能抗体的生物学活性。采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用亲和层析法纯化该产物 ,并用Westernblot和分子排阻层析鉴... 详细信息

构建和表达抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并测定该微型双功能抗体的生物学活性。采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用亲和层析法纯化该产物 ,并用Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物 ;采用免疫荧光法、放射免疫分析法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。DNA序列测定结果表明 :抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体已构建成功 ,表达可溶性产物的产量达 2mg L以上 ,纯化产物中二聚体的比例达 90 % ,具有与Jurkat(CD3 + )和K5 62 A0 2细胞 (Pgp+ )结合的活性 ,与抗CD3ScFv及抗PgpScFv的亲合常数相当。成功地构建了抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并获得高效表达。

关键词：抗CD3 抗Pgp 双功能抗体构建表达肿瘤免疫疗法

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靶向IL-12 p40和TNF-α的双功能抗体可抑制小鼠银屑病发生

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细胞与分子免疫学杂志 2017年第7期33卷 890-895页

作者：徐品谢妮叶才果广东医科大学中美肿瘤研究所广东东莞523080 深圳市第二人民医院检验科广东深圳518035

目的构建具有能同时阻断白细胞介素12(IL-12)/IL-23 p40与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的双功能抗体,并对其生物学功能进行鉴定,观察其对小鼠银屑病的阻断效果。方法根据已有的阿达木单抗(adalimumab)和优特克单抗(ustekinumab)蛋白序列,设... 详细信息

目的构建具有能同时阻断白细胞介素12(IL-12)/IL-23 p40与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的双功能抗体,并对其生物学功能进行鉴定,观察其对小鼠银屑病的阻断效果。方法根据已有的阿达木单抗(adalimumab)和优特克单抗(ustekinumab)蛋白序列,设计、构建并制备了全新的双功能抗体Bi AU003、Bi AU022和Bi AU023。采用ELISA检测抗原抗体结合能力;用TNF-α和双功能抗体处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC),加入FITC标记的内皮白细胞黏附分子1(ELAM-1)抗体,经流式细胞术检测ELAM-1的表达量;用IL-12和双功能抗体处理经IL-2活化的人外周血单个核细胞(PBMC),并用ELISA检测上清液中γ干扰素(IFN-γ)的量;体外实验采用双功能抗体治疗IL-12和TNF-α诱导的银屑病小鼠,HE染色检测病变皮肤厚度。结果3种双功能抗体对其相应的抗原都有较强的亲和力,能明显抑制ELAM-1蛋白的表达和IFN-γ的分泌,并且明显抑制小鼠的银屑病形成,其效果与现有的抗体药阿达木单抗和优特克单抗相当或更优。结论新构建的3种双功能抗体Bi AU003、Bi AU022和Bi AU023,是TNF-α和IL-12/IL-23 p40的阻断剂,能有效阻断小鼠银屑病形成。

关键词：白细胞介素12亚基p40 肿瘤坏死因子α 双功能抗体银屑病

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双功能抗体研究进展

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中国肿瘤生物治疗杂志 1996年第2期3卷 140-143页

作者：冉宇靓杨治华中国医学科学院肿瘤研究所病毒室北京100021

双功能抗体就是双特异性的抗体,是一种非天然抗体,其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。双功能抗体的构建通常采用生物学方法和化学交联法,随着抗体工程及分子生物学技术的发展,最近几年又发展了一类新的构建双功能抗体的方法——基因... 详细信息

双功能抗体就是双特异性的抗体,是一种非天然抗体,其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。双功能抗体的构建通常采用生物学方法和化学交联法,随着抗体工程及分子生物学技术的发展,最近几年又发展了一类新的构建双功能抗体的方法——基因工程法。采用基因工程法不仅能构建多种功能、多种用途的双功能抗体,而且使人源化双功能抗体的构建成为现实。双功能抗体作为一种新的二次导向系统在临床治疗中具有潜在的应用价值。本文从生物学法、化学法以及基因工程法三个方面介绍了双功能抗体构建技术的发展、现状,并进行了展望。

关键词：双功能抗体研究进展化学交联基因工程人源化抗体二次导向系统

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抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定

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中国癌症杂志 2010年第4期20卷 241-246页

作者：李崴范冬梅程昕师锐赞刘荣任思楣王敏杨铭中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 天津医科大学附属肿瘤医院头颈外科天津300060

背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的一种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性。方法:用重叠PC... 详细信息

背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的一种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性。方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达。表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12% SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测生物学活性。结果:基因重组质粒经测序证实序列正确。抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达。12% SDS-PAGE显示28×103和26×103各有一条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符。表达产物经纯化定量可达5mg/L。FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性。结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础。

关键词：基因工程抗体双功能抗体 CD3 CD19 淋巴瘤免疫治疗

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