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植物双元表达载体pCRI1210的构建及其功能验证

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植物遗传资源学报 2017年第5期18卷 960-967页

作者：尹国李世云路正营韩永亮王晔张彦波洪伟东商海红张朝军张雪妍李俊玲李付广邯郸市农业科学院河北邯郸056001 中国农业科学院棉花研究所河南安阳455000

pBI121是转基因研究中的常用载体,但是其多克隆位点相对较少,所携带的GUS基因检测较为复杂。为了增加其多克隆位点,增强其表达效率,简化其检测方法,本研究在pBI121载体的基础上,在其骨架中插入含有CaMV35S启动子、棉花β-tubulin基因内... 详细信息

pBI121是转基因研究中的常用载体,但是其多克隆位点相对较少,所携带的GUS基因检测较为复杂。为了增加其多克隆位点,增强其表达效率,简化其检测方法,本研究在pBI121载体的基础上,在其骨架中插入含有CaMV35S启动子、棉花β-tubulin基因内含子和CaMV 35S polyA终止子的干涉表达框,该表达框含有GFP报告基因。通过验证,所插入的干涉表达框能够正常表达插入的外源基因,且GFP基因可以正常表达。该载体被命名为pCRI1210,它是一种双元植物表达载体,既可以用来当作表达载体,又可以用作干涉载体。本研究为转基因研究提供了一种非常实用的工具。

关键词：双元表达载体 pCRI1210 功能验证

口蹄疫病毒vp1基因的克隆与植物双元表达载体的构建

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中国预防兽医学报 2007年第3期29卷 166-169页

作者：王宝琴王小龙张永光潘丽王文秀中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室南京农业大学动物医学院江苏南京210095 南京农业大学动物医学院

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构蛋白基因vp1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438,构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinF... 详细信息

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构蛋白基因vp1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438,构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinFMDV-VP1。结果表明:vp1基因为639bp。重组中间表达载体pBinVP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明vp1基因、Kozak序列等插入pBinVP1中。在含50mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和50mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行vp1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pBinFMDV-VP1构建正确。

关键词：口蹄疫病毒 vp1基因克隆三亲融合双元表达载体根癌农杆菌

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

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湖北大学学报（自然科学版） 2007年第3期29卷 294-297页

作者：吴文华李新舟湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板... 详细信息

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.

关键词：水稻硝酸盐电子克隆启动子双元表达载体

MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖及分化的影响

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沈阳农业大学学报 2009年第1期40卷 38-42页

作者：吴丹胡兰沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161

为了确定MSTN RNAi双元表达载体pEGFP-N1-M1-M2对成肌细胞增殖和分化的影响,利用脂质体介导法将该双元表达载体转染成肌细胞,MTT法检测MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖的作用,Giemsa染色检测pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体对成肌细胞... 详细信息

为了确定MSTN RNAi双元表达载体pEGFP-N1-M1-M2对成肌细胞增殖和分化的影响,利用脂质体介导法将该双元表达载体转染成肌细胞,MTT法检测MSTN RNAi双元表达载体对成肌细胞增殖的作用,Giemsa染色检测pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体对成肌细胞融合率的影响。试验结果表明,pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体有促进成肌细胞增殖和分化的作用,能够促进成肌细胞大量融合。该结果为进一步探讨MSTN基因的作用机理提供了更为便捷的研究方法。

关键词： MSTN基因双元表达载体成肌细胞增殖分化

FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建

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畜牧与兽医 2005年第9期37卷 3-5页

作者：王宝琴张永光王小龙潘丽王文秀王永录南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV... 详细信息

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。

关键词：口蹄疫病毒 P1基因克隆三亲融合双元表达载体根癌农杆菌

新型HMW-GS基因1Dy12.1^(*t)植物双元表达载体的构建及其遗传转化

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沈阳农业大学学报 2009年第6期40卷 683-687页

作者：张艳贞王轲张静晏月明北京联合大学应用文理学院北京100083 首都师范大学生命科学学院北京100037

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weightglutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1*t为目的基因,利用限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ切割后5’端能形成相同粘性末端的特性... 详细信息

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weightglutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1*t为目的基因,利用限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ切割后5’端能形成相同粘性末端的特性,成功构建了1Dy12.1*t的植物双元表达载体pBINHP-GluT。该载体选择使用胚乳特异性强启动子,利用已知HMW-GS基因内部均不含有的XbaⅠ和KpnⅠ内切酶位点引入1Dy12.1*t编码区,并将1Dy12.1*t的表达调控置于T-DNA区内,从而奠定了其在不同HMW-GS基因功能活性研究上的便利性。通过根癌农杆菌烟草叶盘转化研究目的基因1Dy12.1*t在植物体的表达特性,SDS-PAGE和western blotting鉴定结果表明,1Dy12.1*t在转基因烟草种子胚乳中得到高效表达,进一步证实了所克隆基因的正确性和所构建载体的有效性。

关键词： HMW-GS基因双元表达载体遗传转化植物体高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 限制性内切酶基因功能

新型乙醇诱导表达系统的初步研究及植物双元表达载体的构建

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新型乙醇诱导表达系统的初步研究及植物双元表达载体的构建

作者：王慧内蒙古师范大学

学位级别：硕士

来源于构巢曲霉组成的乙醇诱导系统由两部分组成,分别为AlcR蛋白和一个诱导型启动子,乙醇存在条件下,可改变AlcR蛋白构象,使得原本没有活性的蛋白激活,激活后蛋白会识别诱导型启动子,如alcA启动子上AlcR特异性识别位点,激活启动子进一... 详细信息

来源于构巢曲霉组成的乙醇诱导系统由两部分组成,分别为AlcR蛋白和一个诱导型启动子,乙醇存在条件下,可改变AlcR蛋白构象,使得原本没有活性的蛋白激活,激活后蛋白会识别诱导型启动子,如alcA启动子上AlcR特异性识别位点,激活启动子进一步使得目的基因表达。乙醇诱导系统可在时间和空间上控制目的基因的表达,利用乙醇诱导系统AlcR/alcA进行标记基因的删除验证试验中发现,未诱导条件下乙醇诱导系统AlcR/alcA在原核生物中为组成型表达。为了研发新型乙醇诱导系统,使其在原核生物及真核生物中均为诱导型表达。对同alcA一样受到AlcR调控的启动子进行研究。实验中以构巢曲霉基因组为模板,克隆了alcS、alcM、alcP、alcU、alcR、alcA、aldA自然启动子并测序正确,构建载体pUC19-alcX(aldA)-Cre,利用Cre蛋白可识别两个同向loxp位点并发生删除或重组的Cre/loxp位点特异性重组系统,在原核生物大肠杆菌***中验证在未诱导条件下,自然启动子的启动Cre蛋白表达而删除或重组两个同向loxp位点之间抗性基因情况。具体实验结果为：(1)自然启动子alcS在原核生物中,未诱导条件下启动了Cre表达,并删除了pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因片段;(2)自然启动子alcA、alcU和alcR在原核生物中,未诱导条件下启动Cre表达,并且pYBA100中两个同向loxp位点之间抗性片段发生重组现象;(3)自然启动子alcP、alcS与aldA在原核生物中,未诱导条件下没有启动Cre表达,pYBA100中两个同向loxp位点之间的抗性基因没有发生删除及重组现象。实验结果表明,在原核生物中未诱导条件下,自然启动子alcP、alcS与aldA没有启动Cre表达而发生删除或重组现象,为无泄漏启动子;自然启动子alcA、alcU、alcS和alcR启动了Cre表达而使得两个同向loxp位点之间片段发生删除或重组,为组成型表达启动子。随着除草剂抗性的转基因作物大面积推广种植,抗草甘膦转基因作物作为其中一种得到了广泛关注,而获得草甘膦抗性基因的研究日益增多。在关于抗草甘膦的已注册专利的EPSP合成酶编码序列中发现,来源于农杆菌C58的EPSPS基因仅在原核生物中进行了抗性鉴定,未在植物中进行抗性验证。本研究在以根癌农杆菌C58为模板扩增EPSPS测序正确并改造后,构建了双元表达载体,利用农杆菌介导方法转入拟南芥中。对筛选的转基因阳性苗进行草甘膦浓度抗性测定,实验结果为：在转基因叶片涂施草甘膦浓度为0.02%条件下,转基因阳性苗变黄枯萎,表现抗性低。在此基础上对近年国内获得关于抗草甘膦的基因15项专利进行总结,并对抗草甘膦基因的氨基酸序列建立了系统发育进化树进行分析。所得结果为：(1)来源于农杆菌C58的EPSPS抗性基因在植物中对草甘膦耐性极低,无实际应用价值;(2)利用这些基因的蛋白序列与已知的一些EPSPS蛋白序列建立进化树分析,发现可以按是否含保守序列LGNAGTA将其分为两类;(3)Ⅰ型中(除专利9[87]外)含LGNAGTA保守序列,Ⅱ型中则不含有;(4)源于植物的EPSPS都属于Ⅰ型。新型乙醇诱导系统可用于外源基因的表达,并可在时间和空间上进行调控目的基因的表达。不同来源的EPSPS抗草甘膦基因也可由乙醇诱导系统进行调控表达。将诱导系统与抗性基因构建载体并转入植物中,则可以实现抗性基因表达的可控。

关键词：乙醇诱导启动子双元表达载体草甘膦进化树

MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验

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中国兽医杂志 2013年第7期49卷 11-13,17页

作者：胡兰隋世慧吴丹沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110866

为了建立有效抑制MSTN基因表达的方法,本试验利用基因克隆技术构建MSTN RNAi双元表达载体,并利用脂质体介导转染成肌细胞、用SDS-PAGE和Western blottingf法检测蛋白质的表达。试验结果表明,以TA载体为克隆载体,pHANNIBAL为中间载体,可... 详细信息

为了建立有效抑制MSTN基因表达的方法,本试验利用基因克隆技术构建MSTN RNAi双元表达载体,并利用脂质体介导转染成肌细胞、用SDS-PAGE和Western blottingf法检测蛋白质的表达。试验结果表明,以TA载体为克隆载体,pHANNIBAL为中间载体,可成功构建pEGFP-N1-M1-M2双元表达载体,将其转染成肌细胞48h后,该双元表达载体可明显抑制成肌细胞MSTN基因的表达。

关键词： MSTN基因 RNAi 双元表达载体成肌细胞

豌豆早期结瘤素基因ENOD12A的克隆及与PsLectin基因双元表达载体的构建

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西南师范大学学报（自然科学版） 2009年第3期34卷 202-205页

作者：王洪伟张兴国黎林孙士群秦淑丽苏承刚西南大学园艺园林学院重庆400716

采用PrimStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsENOD12A.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的序列仅相差1个碱基,但推导的氨基酸序列没有改变.将PsENOD12A基因和豌豆凝集素基因psl重组进了双元表... 详细信息

采用PrimStar HS DNA聚合酶从豌豆基因组DNA中扩增出了豌豆早期结瘤素基因PsENOD12A.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的序列仅相差1个碱基,但推导的氨基酸序列没有改变.将PsENOD12A基因和豌豆凝集素基因psl重组进了双元表达载体.

关键词：豌豆早期结瘤素基因凝集素基因双元表达载体