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硫酸乙酰肝素类似物调控肿瘤外泌体形成及功能的研究

硫酸乙酰肝素类似物调控肿瘤外泌体形成及功能的研究

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作者：吴小涛江南大学

学位级别：硕士

目前,恶性肿瘤是困扰整个人类的一大难题,其本身具有强烈的侵袭性和转移性,而外泌体作为细胞间通讯的重要媒介,一开始被认为是细胞代谢废物,后来研究发现在肿瘤发展的这一进程中,外泌体的影响日渐凸显。越来越多的研究表明,在未来外泌... 详细信息

目前,恶性肿瘤是困扰整个人类的一大难题,其本身具有强烈的侵袭性和转移性,而外泌体作为细胞间通讯的重要媒介,一开始被认为是细胞代谢废物,后来研究发现在肿瘤发展的这一进程中,外泌体的影响日渐凸显。越来越多的研究表明,在未来外泌体或将成为癌症治疗的一个靶点,在肿瘤难题的攻克中或将发挥重要的作用。硫酸乙酰肝素(HS)作为线性多糖的一种,分布在细胞膜和细胞外基质中,在生理病理过程中都扮演着重要的角色,尤其在肿瘤的发生和发展过程当中发挥了重要的作用。研究表明HS在外泌体的生物合成和分泌过程中发挥着重要的作用,但其结构和功能的关系尚未明晰。因此本研究旨在合成结构确定的HS类似物,研究不同硫酸化位点和不同分子量大小的HS类似物对肿瘤细胞合成外泌体的大小、数量、组成的影响。并进一步探讨HS类似物介导肿瘤细胞产生的外泌体对肿瘤细胞生物学功能的影响,从而为肿瘤微环境的调控及肿瘤干预研究提供科学依据和新策略。主要研究内容如下:(1)硫酸乙酰肝素类似物的制备和表征。从肝素出发,通过化学衍生法进行去硫酸化改造,制备得到6-O-去硫酸化肝素,主要采用的去硫酸化试剂是N,O-三甲基三氟乙酰胺(BTSA)。通过FT-IR、H-NMR、C-NMR的方法进行产物的结构表征,通过GPC-MALLS的方法来确定样品的分子量。同时,使用Zeta电位仪测定了样品的Zeta电位;使用元素分析仪对样品的元素含量进行测定,在进行一系列表征后,证实成功制备了6-O-DeSH。(2)硫酸乙酰肝素类似物对肿瘤外泌体生成的影响。通过在小鼠黑色素瘤细胞中加入HS类似物刺激获得外泌体,得到不同结构的HS诱导产生的外泌体,采用的外泌体提取方法有差速离心法,试剂盒提取法以及超滤离心法。在外泌体的表征方面,通过透射电镜(TEM)观察外泌体的形态,通过纳米粒子追踪技术(NTA)以及动态光散射(DLS)的方法测定了外泌体粒径的大小,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)进行外泌体标记性蛋白的检测(CD63、TSG101),确定成功提取出了外泌体。分别采用了NTA法、BCA法、Western blot法来探讨不同的HS类似物对外泌体生成的粒径大小、外泌体数量及组成的影响。结果表明,HS类似物的分子量变化、硫酸化位点变化对外泌体的分泌和组成产生的影响较为显著,但是对粒径的大小并未产生明显的影响。(3)硫酸乙酰肝素类似物对肿瘤外泌体功能的影响。通过细胞毒性实验、细胞划痕实验、Transwell的迁移和侵袭实验来探讨不同的HS类似物对肿瘤细胞增殖迁移和侵袭的影响。结果表明,不同分子量的HS类似物对外泌体功能的影响并不显著,但在不同硫酸化位点修饰的HS类似物中,肝素组的外泌体对肿瘤细胞的增殖迁移以及侵袭功能有显著的抑制作用,在6-O硫酸化基团去除后,抑制功能明显减弱,说明硫酸化位点对其功能的影响作用显著。在迁移、侵袭功能的研究方面,也发现了和增殖实验中类似的实验结果。为了初步探讨不同HS类似物对功能的影响机制,通过Western blot法测定外泌体中乙酰肝素酶的表达,通过ELISA法来测定外泌体细胞因子的表达,结果表明肝素刺激的肿瘤细胞所分泌的外泌体的乙酰肝素酶含量明显降低。与此同时,细胞因子的检测发现,肝素和低分子量肝素组别的IL-6细胞因子的表达较低,而在IL-10以及TGF-β的细胞因子表达上呈现出较高的表达。6-O位置的硫酸根去除后,IL-10以及TGF-β的细胞因子无显著变化,IL-6表达较高。表明该位点的硫酸化对外泌体细胞因子的表达起到关键的介导作用。综上所述,本研究通过不同结构的HS类似物,探讨了它们对肿瘤外泌体生成及其功能的影响。结果表明,HS类似物分子量变化对外泌体生成及功能的影响显著,同时,HS类似物中的6-O硫酸根基团在这一过程中发挥着重要的作用,一旦缺失,相应的功能显著减弱,其可能的机制在于不同结构HS类似物通过调控肿瘤外泌体负载相关蛋白的表达而影响肿瘤外泌体的生物学功能。

关键词：硫酸乙酰肝素肝素去硫酸化外泌体肿瘤细胞增殖迁移侵袭

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