检索结果-南通市图书馆

作者：徐子凡桂林医学院

学位级别：硕士

目的:尽管去泛素化酶7(USP7)在癌症发展中的重要性已得到充分证实,但其在肝细胞癌(HCC)中的作用和潜在机制在很大程度上仍然未知。Aurora B在HCC进展中同样起着重要作用,然而控制其在HCC中蛋白质稳定性的调节机制尚不清楚。本研究利用Ub... 详细信息

目的:尽管去泛素化酶7(USP7)在癌症发展中的重要性已得到充分证实,但其在肝细胞癌(HCC)中的作用和潜在机制在很大程度上仍然未知。Aurora B在HCC进展中同样起着重要作用,然而控制其在HCC中蛋白质稳定性的调节机制尚不清楚。本研究利用Ubi Brower网站预测出Aurora B上游的去泛素化酶USP7,进而探讨去泛素化酶USP7调控Aurora B蛋白稳定性的分子机制及其在肿瘤发生发展中的生物学功能。方法:1.利用免疫共沉淀技术检测USP7与Aurora B之间是否相互作用。2.利用实时荧光定量PCR检测USP7对Aurora B的m RNA表达水平的影响。3.采用放线菌酮CHX(Cycloheximide)追逐实验和体内泛素化实验,检测USP7对Aurora B的去泛素化作用。4.利用CCK-8、transwell和划痕实验等细胞实验检测USP7以及Aurora B对肝细胞癌增殖迁移的影响。5.采用裸鼠皮下成瘤实验检测USP7抑制剂以及Aurora B抑制剂对裸鼠皮下瘤的治疗效果。6.采用免疫组化实验检测USP7与Aurora B在HCC临床组织样本中表达的相关性及其与患者生存率之间的关系。结果:1.免疫共沉淀实验确定了USP7与Aurora B之间的相互作用。2.泛素化相关实验证实了USP7去泛素化Aurora B并且依赖于它的去泛素化酶活性。3.细胞学实验证实了USP7能够促进细胞增殖迁移,并且敲低Aurora B能够抵消这种促增殖迁移现象。4.裸鼠皮下成瘤实验1发现共同抑制Aurora B和USP7可以减轻肝细胞癌的体内成瘤大小。5.免疫组化结果显示相对于正常肝组织,USP7和Aurora B在肝癌组织中均高表达,并且USP7与Aurora B表达呈正相关,USP7和Aurora B的高表达与HCC患者的预后不良有关,并且可以作为独立的预测因子。结论:USP7与Aurora B存在相互作用并且USP7通过依赖其去泛素化酶活性去泛素化Aurora B。USP7还可以通过调节Aurora B蛋白稳定性促进细胞增殖迁移。这些发现揭示了USP7-Aurora B轴在推动肝细胞癌中的作用,这可能进一步发展为一种新的肝细胞癌治疗策略。

关键词： USP7 Aurora B 肝细胞癌去泛素化

去泛素化蛋白酶USP53在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究

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去泛素化蛋白酶USP53在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制研究

作者：姚烨武汉大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,但其发病机制尚未完全阐明。在HCC的发生、发展过程中,泛素化-去泛素化系统发挥着非常重要的作用,本研究旨在探讨去泛素化酶USP53在肝细胞癌... 详细信息

研究背景与目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,但其发病机制尚未完全阐明。在HCC的发生、发展过程中,泛素化-去泛素化系统发挥着非常重要的作用,本研究旨在探讨去泛素化酶USP53在肝细胞癌组织中和肝癌细胞系中表达及其对肝癌预后的影响,在此基础之上,进一步研究USP53对HCC生物学行为的影响及其具体分子机制。研究方法:从TCGA-LIHC数据库中下载肝癌组织基因表达信息,分析肝细胞癌组织和癌旁组织中USP53 m RNA表达水平的差异;利用KM Plotter数据库分析肝细胞癌中USP53 m RNA表达水平与患者复发和生存的关系。随后收集33对肝细胞癌组织和癌旁组织,检测USP53 m RNA和蛋白水平在癌组织和癌旁组织的表达量。提取5种肝癌细胞系和人类永生化肝细胞系L02的总RNA和总蛋白,并检测USP53在不同细胞系中的表达差异。通过质粒和慢病毒的方法,对USP53进行过表达,通过体内和体外方法探究USP53对肝细胞癌肿瘤生物学行为的影响,通过CCK-8、Ed U染色、克隆形成实验、划痕实验、trans-well试验、流式细胞学等实验检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡比例和周期分布,并构建小鼠皮下瘤模型和原位肝癌模型研究USP53在体内对肝细胞癌肿瘤生长的影响。接着用免疫沉淀和质谱分析的方法寻找USP53的互作分子,并通过免疫共沉淀(CO-IP)、邻位连接(Proximity Ligation Assay,PLA)、免疫荧光(IF)和GST-pull down验证其相互作用。为了研究其互作机制,我们进行了MG132降解实验和CHX稳定性试验,并对下游分子进行免疫沉淀后检测其泛素化程度改变。最后我们设计针对USP53和其下游分子的功能回复实验,通过CCK8、TUNEL荧光染色、流式细胞学凋亡检测、caspase-3活性检测等方法检测我们所观察到的功能是否可以被下游分子所回复。研究结果:在TCGA-LIHC队列中,肝癌组织中USP53 m RNA的表达量显著低于癌旁组织(P泛素化-蛋白酶体途径降解,CHX稳定性试验表明过表达USP53后CYCS蛋白稳定性增加,RNA水平没有改变。泛素化检测证明过表达USP53后CYCS泛素化程度降低。回复实验中共转染si-USP53和CYCS过表达质粒后,通过CCK8、tunel荧光染色、流式细胞学凋亡检测、caspase-3活性检测等检测到肝癌细胞凋亡程度比单纯过表达CYCS有所下降。结论:去泛素化酶USP53在肝细胞癌组织和细胞系中表达下调,其低表达与肿瘤恶性程度和不良预后相关。体内体外试验证实USP53在肝细胞癌中发挥着抑癌作用,通过去泛素化CYCS并增强了其蛋白稳定性,从而促进肝癌细胞凋亡,发挥抑制肝癌发生发展的作用。

关键词：泛素特异性蛋白酶53 细胞色素C 肝细胞癌凋亡去泛素化

去泛素化酶STAMBPL1在食管癌中的促癌作用机理研究

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去泛素化酶STAMBPL1在食管癌中的促癌作用机理研究

作者：刘嘉轩北京化工大学

学位级别：硕士

食管癌是常见的上消化道疾病,严重危害了人们的健康,其中以食管鳞状细胞癌最为常见。食管癌的风险因素复杂,起病隐匿,转移和侵袭性强,预后严峻,因此亟需探索出食管癌的诊断和治疗靶点。泛素化是在细胞内普遍发生的蛋白质翻译后修饰类型... 详细信息

食管癌是常见的上消化道疾病,严重危害了人们的健康,其中以食管鳞状细胞癌最为常见。食管癌的风险因素复杂,起病隐匿,转移和侵袭性强,预后严峻,因此亟需探索出食管癌的诊断和治疗靶点。泛素化是在细胞内普遍发生的蛋白质翻译后修饰类型,在蛋白质的分类定位、调节代谢、功能变化等方面都扮演了至关重要的角色。泛素化几乎存在于生理活动的各个方面,尤其在癌症方面泛素化是如今的研究热点。去泛素化酶是泛素化过程中一类重要的功能蛋白,其主要功能是识别被泛素标记的蛋白并将泛素从底物蛋白中释放出来。STAMBPL1是一种特异性识别K63泛素链的去泛素化酶,如今已有多篇文章报道其在多种癌症进展中的作用,但其在食管癌中的作用以及分子机制尚未有研究报道。本论文系统地研究去泛素化酶STAMBPL1在食管癌中的作用机理,主要内容和结论如下:本课题结合生信数据分析、细胞实验和动物实验等手段进行研究。查阅相关数据库发现,与正常食管组织相比,在食管肿瘤组织中STAMBPL1高度表达且与食管癌患者不良预后相关。通过生信网站预测和细胞实验证明转录因子ETV5激活食管癌细胞中STAMBPL1的表达。通过表型实验和分子生物学实验证明,在食管癌细胞系中敲低STAMBPL1通过抑制EGFR信号通路和TGF-beta信号通路的活化,激活p53信号通路抑制细胞增殖、迁移和体内成瘤能力,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。结合质谱数据和体外细胞实验,发现STAMBPL1部分通过去泛素化组蛋白阅读器SPIN1并稳定其蛋白水平,促进食管癌的恶性进展。上述研究结果探讨了去泛素化酶STAMBPL1促进食管癌的肿瘤进展的作用机理。系统性地证明ETV5/STAMBPL1/SPIN1/EGFR轴在食管癌恶性进展中的作用。去泛素化酶STAMBPL1作为食管癌分子诊断的生物标志物和临床治疗的靶点具有潜在价值。

关键词：去泛素化 STAMBPL1 SPIN1 食管癌

去泛素化酶USP10通过稳定YAP1的表达促进骨肉瘤上皮间质转化和转移的作用研究

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去泛素化酶USP10通过稳定YAP1的表达促进骨肉瘤上皮间质转化和转...

作者：邓建勇南昌大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:骨肉瘤是常见于儿童、青少年的来源于骨组织的一种恶性肿瘤,特征是恶性程度高、生长迅速、容易转移,目前骨肉瘤的治疗仍是一项重大挑战。USP10可以将细胞质中的蛋白质进行去泛素化,从而参与调节细胞生长、迁移和凋亡等,... 详细信息

研究背景和目的:骨肉瘤是常见于儿童、青少年的来源于骨组织的一种恶性肿瘤,特征是恶性程度高、生长迅速、容易转移,目前骨肉瘤的治疗仍是一项重大挑战。USP10可以将细胞质中的蛋白质进行去泛素化,从而参与调节细胞生长、迁移和凋亡等,进而影响肿瘤细胞的发生发展。YAP1作为Hippo信号通路的重要下游效应器中YAP的亚型之一,在肿瘤细胞增殖、凋亡、自噬和远处转移中扮演着重要的角色。有研究发现USP10和YAP1均可参与调节肿瘤细胞的上皮间质转化和远处转移,进而影响肿瘤的发生发展。但两者在骨肉瘤中的作用及机制研究甚少。本研究主要探讨骨肉瘤中USP10、YAP1的表达及其相关性,并研究骨肉瘤中USP10对上皮-间质转化和肿瘤转移的影响,目的是为骨肉瘤患者的临床靶向治疗提供新的理论和依据。方法:1、通过免疫组化、实时荧光定量及蛋白印迹法分析USP10在骨肉瘤组织中的表达水平,通过实时荧光定量及蛋白印迹法检测正常成骨细胞及骨肉瘤细胞系中USP10表达水平。2、将构建好的shUSP10质粒感染骨肉瘤细胞系中USP10高表达的细胞系,筛选出下调shUSP10水平最明显的质粒进行实验。通过蛋白印迹法观察经过shUSP10质粒感染骨肉瘤细胞系后的上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达水平的变化,然后通过划痕愈合实验、Transwell实验方法观察并分析细胞侵袭、迁移能力的变化。并且,通过尾静脉注射稳定转染sh NC/143B、shUSP10/143B的骨肉瘤细胞株,观察裸鼠骨肉瘤肺转移的发生。3、通过免疫组化、实时荧光定量及蛋白印迹法分析骨肉瘤组织及癌旁组织中YAP1的表达水平,并分析骨肉瘤组织中USP10与YAP1的相关性。通过改变骨肉瘤细胞中USP10表达后,进一步分析YAP1的表达。然后在shUSP10骨肉瘤细胞系中上调YAP1及过表达USP10细胞系中抑制YAP1的表达,通过Western blot实验方法分析EMT相关的蛋白表达情况及Transwell实验观察细胞侵袭及迁移能力。最后,通过Co-IP方法检测骨肉瘤细胞系中USP10是否能直接与YAP1相互结合,4、在使用蛋白酶体抑制剂(MG132)作用下,通过Western blot检测USP10对YAP1表达水平的影响。结果:1、骨肉瘤及其邻近组织的免疫组化分析显示:USP10在72.41%(21/29)的骨肉瘤组织中高表达,但在癌旁组织中仅检出升高为17.24%(5/29)(p化分析发现YAP1表达水平显著高于癌旁组织,且YAP1表达USP10的表达呈正相关。同时,此研究还发现在shUSP10细胞株中经过上调YAP1的表达后可以挽救骨肉瘤的EMT,同时骨肉瘤的侵袭、转移能力增强;反过来,在骨肉瘤中过表达USP10后下调YAP1的表达则可以抑制骨肉瘤的EMT,骨肉瘤的侵袭、转移能力也下降。我们通过Co-IP证实了USP10与YAP1能直接结合相互产生作用。4、我们还证实了在骨肉瘤细胞中,YAP1的表达随着使用蛋白酶体抑制剂MG132的作用时间延长而增加。在改变肿瘤细胞中USP10的表达后,使用MG132处理后可发现YAP1的表达与对照组对比并未发生明显的变化,并且在骨肉瘤细胞中YAP1蛋白降解速率明显下降。最后,我们的研究证实USP10能够通过去泛素化稳定YAP1的表达促进骨肉瘤上皮间质转化和转移。结论:我们通过体内和体外实验观察到USP10可以通过稳定YAP1的表达促进骨肉瘤

关键词： USP10 YAP1 骨肉瘤上皮-间质转化去泛素化

去泛素化酶USP13通过提高NLRP3蛋白稳定性促进NLRP3炎症小体活化

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去泛素化酶USP13通过提高NLRP3蛋白稳定性促进NLRP3炎症小体活化

作者：李柯颖青岛大学

学位级别：硕士

目的NLRP3炎症小体是天然免疫的重要组成部分,由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和Pro-Caspase-1组成。NLRP3炎症小体异常活化与多种疾病的发生发展相关,深入研究NLRP3炎症小体活化的分子机制具有重要意义。NLRP3蛋白的稳定性对NLRP3炎症小体活化至关重要,受到多种翻译后修饰的严密调控,但具体的分子机制并未完全揭示。泛素特异性蛋白酶13(Ubiquitin-specific protease 13,USP13)是泛素特异性蛋白酶家族重要的成员之一,通过调节底物的去泛素化参与肿瘤、炎症、自噬和内质网相关降解等多种生理病理过程。近年,有研究提示USP13参与调控NLRP3炎症小体活化,但缺乏动物水平的证据且分子机制不明。本论文旨在利用USP13敲除小鼠明确USP13对NLRP3炎症小体活化的调节作用,并解析其分子机制。方法分离培养野生型(Wild type,WT)和USP13敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞(Mouse bone marrow-derived macrophages,BMDMs)和腹腔驻留巨噬细胞(Peritoneal resident macrophages,PRMs);利用RNAi技术建立人THP-1 USP13敲低细胞;检测这些细胞NLRP3炎症小体活化状况,包括:流式编码微球芯片技术(Cytometric bead array,CBA)检测上清中IL-1β的分泌,Western blot检测Caspase-1活化以及炎症通路的活化情况,免疫荧光检测NLRP3炎症小体的组装。NLRP3蛋白质稳定性采用CHXchase实验检测;NLRP3泛素化水平采用Western blot检测。比较WT小鼠和USP13敲除小鼠对尿酸单钠(Monosodium urate,MSU)诱导腹膜炎、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导败血症以及缺乏蛋氨酸胆碱(Methionine-choline deficient,MCD)饲料诱导非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)的反应性。ELISA检测血清中转氨酶的释放;H&E染色和油红染色观察肝脏脂质积累情况,马松染色观察肝脏纤维化程度,Real-time PCR检测纤维化相关基因转录水平的表达;CBA和Western blot检测MCD模型中NLRP3炎症小体的活化。结果在BMDMs、PRMs和THP-1来源的巨噬细胞中,敲除USP13抑制NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β的分泌;在PRMs中,敲除USP13抑制Caspase-1的激活及NLRP3炎症小体的组装,但不影响PRMs对LPS的反应性,表明缺失USP13抑制NLRP3炎症小体的活化。CHX-chase实验显示缺失USP13降低NLRP3半衰期。过表达野生型USP13和USP13酶活突变体都可以促进NLRP3去泛素化,且USP13抑制剂Spautin-1并不能逆转USP13对NLRP3泛素化的影响,说明USP13对NLRP3泛素化的调节不依赖其酶活性。USP13可以抑制E3泛素连接酶TRIM31介导的NLRP3的泛素化及其降解。利用NLRP3炎症小体驱动的多种炎症疾病模型,我们发现USP13缺失显著降低MSU诱导的腹腔IL-1β产生和炎症细胞侵入,并抑制了LPS诱导的IL-1β和IL-6产生。USP13敲除不影响MCD诱导的肝脏脂肪积累,但明显改善了肝脏纤维化。结论USP13缺失抑制NLRP3炎症小体活化,减轻MSU诱导的腹膜炎、LPS诱导的败血症和MCD诱导的肝纤维化。机制上,USP13可能通过抑制TRIM31对NLRP3的泛素化降解,提高NLRP3蛋白稳定性。

关键词： NLRP3 USP13 去泛素化稳定性

去泛素化酶OTUD1通过促进Parkin降解参与帕金森病

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去泛素化酶OTUD1通过促进Parkin降解参与帕金森病

作者：吴梦婷山东大学

学位级别：硕士

帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元发生进行性丢失而导致的神经退行性疾病,其发病机制目前尚不明确,大量的研究表明帕金森病是基因和环境共同作用的结果。根据发病机制不同可以将PD分为家族... 详细信息

帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种由于中脑黑质致密部多巴胺能神经元发生进行性丢失而导致的神经退行性疾病,其发病机制目前尚不明确,大量的研究表明帕金森病是基因和环境共同作用的结果。根据发病机制不同可以将PD分为家族性PD和散发性PD。其中,编码E3泛素连接酶Parkin的基因parkin发生异常突变是导致常染色体隐性遗传性PD最常见的原因,由于Parkin介导的线粒体自噬在维持线粒体稳态中发挥极大的作用,因此,除了参与家族性PD的发病机制,Parkin蛋白功能异常还会导致散发性PD的发生。Parkin的泛素化水平与自身的活性及稳定性关系密切,泛素化修饰是一个可逆的过程,Parkin上连接的泛素链也能够被去泛素化酶水解移除,目前关于“去泛素化酶参与调控Parkin功能或稳定性”的报道甚少,因此,我们首先从OTU家族中筛选出了作用于Parkin的去泛素化酶OTUD1,发现OTUD1通过与Parkin相互结合并依赖自身的酶活性对Parkin进行去泛素化,负调Parkin的蛋白水平,同时减少Parkin向受损线粒体的招募。进一步研究发现,OTUD1主要通过去除Parkin上连接的多聚泛素链,促进该分子通过自噬溶酶体途径降解,从而降低Parkin的蛋白水平。此外,我们进一步在体内实验中证实了 OTUD1缺失能够减轻MPTP诱导的小鼠PD模型中多巴胺能神经元的损伤,改善小鼠的运动能力,这可能与上调Parkin的蛋白水平有关。综上所述,本课题研究阐明了去泛素化酶OTUD1作为Parkin的重要调节蛋白,通过去泛素化修饰作用调控Parkin蛋白的稳定性,影响线粒体稳态并最终参与帕金森病的发生与发展。该研究丰富了 Parkin蛋白稳定性的调节机制,为揭示帕金森病的发病机制提供了新的思路,OTUD1也因此成为临床防治帕金森病的又一新的潜在靶点。

关键词：帕金森病 OTUD1 Parkin 去泛素化线粒体功能障碍

基于生物信息学方法构建宫颈癌去泛素化相关预后模型

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基于生物信息学方法构建宫颈癌去泛素化相关预后模型

作者：陆艺大连医科大学

学位级别：硕士

目的:探究去泛素化与宫颈癌患者的预后相关性,同时构建一个宫颈癌去泛素化相关预后模型,对宫颈癌患者的预后评估及分子机制研究提供思路。方法:从TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）下载宫颈癌基因表达数据,从iUUCD... 详细信息

目的:探究去泛素化与宫颈癌患者的预后相关性,同时构建一个宫颈癌去泛素化相关预后模型,对宫颈癌患者的预后评估及分子机制研究提供思路。方法:从TCGA数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）下载宫颈癌基因表达数据,从iUUCD2.0数据库（integrated annotations for Ubiquitin and Ubiquitin-like Conjugation Database,ver2.0,泛素和类泛素结合数据库2.0）下载去泛素化基因数据,进行差异表达分析后得到去泛素化DEGs（Differentially Expressed Genes,差异表达基因）。利用ssGSEA分析（single sample Gene Set Enrichment Analysis,单样本基因富集分析）基于上述基因获得宫颈癌去泛素化相关得分,评估去泛素化与宫颈癌预后相关性。基于该得分通过WGCNA（Weighted Correlation Network Analysis,加权基因共表达网络分析）聚类得到不同模块,筛选出与去泛素化相关性最强的模块,获得关键基因,利用Cox回归分析获得预后相关基因,得到宫颈癌去泛素化风险评分并构建预后模型。利用KM生存曲线和AUC（Area Under Curve,ROC曲线下面积）对患者总生存率进行预测以评价该模型的预测质量。从GEO数据库（Gene Expression Omnibus,基因表达综合数据库）获取宫颈癌数据作为外部验证,评估该模型的预测能力。利用富集分析寻找重要生物学途径并分析该模型与多种临床特征的关系。结果:从TCGA数据库中获得306例宫颈癌样本,其中293例具有完整临床数据,从iUUCD2.0数据库中获取并整合98个具有表达信息的人类DUBs（Deubiquitinase,去泛素化酶）数据,差异表达分析后得到宫颈癌去泛素化DEGs共47个（其中上调基因8个,下调基因39个）。富集分析显示这些基因主要参与蛋白质翻译后修饰、水解等生物学过程。基于上述DEGs对TCGA宫颈癌样本进行ssGSEA分析,得到宫颈癌去泛素化相关得分,基于最佳节点将TCGA样本分为高低风险组,组间KM生存曲线差异显著（p=0.032）。基于去泛素化相关得分对宫颈癌样本的蛋白编码基因进行WGCNA分析,聚类后共得到3个模块,筛选出2067个关键基因,利用单因素Cox回归分析得到143个OS相关基因,Lasso回归分析后得到一个由24个基因组成的风险评分,以此构建宫颈癌去泛素化相关预后模型。Kaplan-Meier分析表明,该模型在TCGA数据集中可区分高低风险组患者（p化T细胞分布较多。结论:1.去泛素化与宫颈癌预后具有相关性。2.本研究整合了一个去泛素化相关基因宫颈癌风险评分模型,该模型是宫颈癌患者的独立预后因素,在宫颈癌患者的预后评估中具有临床意义。3.风险评分模型与TNM分期中的T分期、BMI指数及免疫细胞浸润有关,其中T分期越晚,评分越高;BMI小于24kg/m,评分较高;高风险评分组中央型记忆T细胞分布较多,低风险评分组活化T细胞分布较多。

关键词：妇科肿瘤宫颈癌预后模型去泛素化

UAF1-USP1去泛素化酶复合体稳定cGAS并促进抗病毒免疫反应

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UAF1-USP1去泛素化酶复合体稳定cGAS并促进抗病毒免疫反应

作者：马晨凯山东大学

学位级别：硕士

环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)是启动天然免疫应答的关键模式识别受体。cGAS检测病毒DNA或基因组不稳定导致的细胞质DNA的出现,并合成第二信使环鸟苷酸—腺苷酸(cyc... 详细信息

环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)是启动天然免疫应答的关键模式识别受体。cGAS检测病毒DNA或基因组不稳定导致的细胞质DNA的出现,并合成第二信使环鸟苷酸—腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP),进而通过干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)诱导Ⅰ型干扰素的表达。cGAS-STING信号通路在抗病毒免疫反应中起着重要作用。然而,细胞质中的自体DNA被识别后导致的cGAS的异常活化与自身炎症性疾病、衰老和恶性肿瘤等有关。因此,应严格控制cGAS的活化,以防御病毒感染并避免有害的免疫疾病。cGAS-STING信号通路的活化与cGAS的表达水平有关。多种翻译后修饰,如泛素化和SUMO化,通过控制cGAS蛋白的稳定性,以此微调其激活水平。自噬受体p62检测cGAS的K48位的多泛素化,以促进其自噬体降解。去泛素化酶USP14和USP29介导K48位的去泛素化以增强cGAS稳定性。分别由TRIM38和SENP2介导的cGAS的SUMO化和去SUMO化也可以控制cGAS稳定性。然而,控制cGAS稳定性的更深层机制,尤其是其在病毒感染期间的反馈调节,在很大程度上仍然未知。泛素特异性肽酶 1(ubiquitin specific peptidase 1,USP1)相关因子 1(USP1-associated factor 1,UAF1,也称为WDR48或p80)是三种去泛素化酶的伴侣蛋白,包括 USP1、USP12 和 USP46。UAF1 组成性地与 USP1、USP12 和 USP46结合,形成去泛素化酶复合体,从而增强其去泛素化酶活性。UAF1/USP1复合体在多种生物学过程中发挥调节作用,如DNA损伤反应和肿瘤发病机制。UAF1/USP1复合体去泛素化并稳定DNA结合抑制剂ID1,ID2,ID3。从而抑制成骨细胞分化并增强增殖。UAF1/USP12通过去泛素化作用稳定B细胞淋巴瘤/白血病10(BCL10),从而激活CD4+T细胞信号。此前,我们还发现了 UAF1/USP1去泛素化酶复合体可以稳定TBK1和NLRP3,并促进RLR和炎症小体的活化。ML323是UAF1/USP1去泛素化酶复合体的特异性抑制剂,能在体内减弱RLR驱动的IFN反应并改善NLRP3依赖性炎症。这些发现表明UAF1/USP1可能是药物设计的一个靶点。然而,UAF1/USP1去泛素化酶复合体是否具有其他靶点及其在cGAS激活中的潜在作用,仍需要研究。在本研究中,我们发现病毒感染能够诱导UAF1/USP1的表达。Uaf1缺陷和ML323处理都减弱了 cGAS介导的抗病毒免疫反应,并促进了病毒复制。机制上,UAF1和USP1都与cGAS相互作用,介导其K48位去泛素化,从而稳定其蛋白质表达。因此,我们的研究揭示了去泛素化酶复合体UAF1/USP1靶向cGAS抗病毒固有免疫反应的调节机制,并为治疗cGAS异常活化引起的疾病提供了潜在的靶点。

关键词： cGAS 去泛素化抗病毒免疫 USP1 UAF1

嗜肺军团菌效应蛋白MavC与MvcA介导的新型泛素化与去泛素化反应的结构生物学研究

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嗜肺军团菌效应蛋白MavC与MvcA介导的新型泛素化与去泛素化反应的...

作者：李栋北京化工大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌在入侵宿主细胞后,能够通过分泌一系列效应蛋白,借助泛素化修饰作用,延缓宿主细胞凋亡,加快自身繁殖并维持其感染。泛素是一种小分子量蛋白质,能够参与细胞凋亡等多种重要生理活动。它能通过与目的蛋白共价连接,使其携带泛素... 详细信息

嗜肺军团菌在入侵宿主细胞后,能够通过分泌一系列效应蛋白,借助泛素化修饰作用,延缓宿主细胞凋亡,加快自身繁殖并维持其感染。泛素是一种小分子量蛋白质,能够参与细胞凋亡等多种重要生理活动。它能通过与目的蛋白共价连接,使其携带泛素标签,完成对靶蛋白的泛素化。传统的泛素化过程是一个经典的三酶级联反应,而嗜肺军团菌的效应蛋白MavC则能够以非常规的方式催化底物UBE2N的泛素化,仅需两步即可完成泛素化过程。同时,嗜肺军团菌的另一种效应蛋白MvcA,则可以对由MavC催化产生的新型泛素化产物进行去泛素化过程。这两种效应蛋白在氨基酸序列上有约50%的同源度,但功能上却几乎截然相反。此外,嗜肺军团菌中的另一种效应蛋白Lpg2149,则能够同时抑制MavC的泛素化以及MvcA的去泛素化活性,从而对二者活性进行调控。但上述过程的分子机理尚未研究清楚。本论文解析了MvcA与其底物,即MavC催化生成的UBE2N-Ub蛋白的复合物结构,以及MvcA与其抑制剂Lpg2149的复合物结构,分析了MvcA去泛素化的分子机理以及Lpg2149对MvcA活性的抑制机理。经过对MavC与MvcA两种效应蛋白的自身结构及其相关复合物结构的比对,结合多种蛋白质互作检测手段分析,本论文提出了MavC与MvcA这两个序列上高度相似的蛋白质所展现出的几乎截然相反的活性的分子机制。同时,本论文还设计了一系列MavC与MvcA在活性位点附近的氨基酸残基互换的突变体,并通过改变个别残基,获得了活性逆转的MavC突变体蛋白。本论文的工作对于我们理解蛋白质的功能进化以及蛋白质结构和功能的关系有着深刻的启发意义,同时,针对MavC和MvcA的结构生物学研究也为未来设计二者的抑制剂以及治疗军团菌肺炎的相关药物奠定了结构基础。

关键词： MavC MvcA 泛素化去泛素化复合物

鸡USP7通过促进MyD88去泛素化和蛋白稳定性增强鸡的免疫应答和抗病力

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鸡USP7通过促进MyD88去泛素化和蛋白稳定性增强鸡的免疫应答和抗...

作者：张娜中国农业科学院

学位级别：硕士

TLRs受体是相对保守的模式识别受体,广泛参与细菌、真菌、非甲基化双链DNA、单链RNA及脂蛋白等病原分子模式的识别。TLRs信号依赖于接头蛋白MyD88向下传导,导致NF-κB的激活诱导炎性细胞因子的表达。MyD88蛋白水平的高低与免疫应答的强... 详细信息

TLRs受体是相对保守的模式识别受体,广泛参与细菌、真菌、非甲基化双链DNA、单链RNA及脂蛋白等病原分子模式的识别。TLRs信号依赖于接头蛋白MyD88向下传导,导致NF-κB的激活诱导炎性细胞因子的表达。MyD88蛋白水平的高低与免疫应答的强弱有着至关重要的联系,MyD88被多种翻译后修饰调控,包括泛素化磷酸化、去泛素化等。目前有多个关于调控MyD88降解的泛素化酶报道,但是对可以增强其稳定性的去泛素化酶的研究相对较少,本研究主要关注MyD88去泛素化的分子机制,发现去泛素化酶USP7通过稳定MyD88蛋白水平影响机体先天免疫和抗病力的分子机制。全文结论如下:(1)ChMyD88与ChUSP7相互作用并在细胞质中共定位。我们在鸡胚胎成纤维细胞(DF1)中外源表达chUSP7和chMyD88,通过蛋白免疫共沉淀和western blot实验证实二者存在相互作用,免疫荧光共聚焦实验检测到二者在细胞质中存在共定位。(2)ChUSP7促进chMyD88蛋白稳定性。在DF1中外源表达chUSP7后chMyD88的蛋白水平呈现剂量依赖性的增加。此外,使用siRNA干扰chUSP7后,在翻译抑制剂CHX存在下,内源性敲低chUSP7导致chMyD88蛋白丰度降低。然而,不论过表达还是敲低chUSP7,chMyD88的mRNA水平保持不变,表明USP7在翻译后水平而不是在转录后水平调控MyD88的表达。(3)ChUSP7促进chMyD88的K48类型去泛素化。在DF1细胞中过表达USP7、MyD88以及泛素Ub质粒后,免疫共沉淀实验证实MyD88的泛素化明显降低,将USP7和MyD88与K63、K48类型的泛素质粒共转染,免疫共沉淀结果显示chUSP7的过表达有效地降低了chMyD88的K48类型而不是K63类型的泛素化。(4)ChUSP7负调节鸡巨噬细胞中促炎细胞因子的产生。过表达或敲低鸡巨噬细胞(HD11)中chUSP7基因表达,用TLR4激动剂LPS处理细胞,qRT-PCR检测TLR4通路下游免疫因子IL-1β和IL-8的表达,结果发现,过表达chUSP7后免疫因子表达量增加,敲低chUSP7后结果相反,上述结果表明chUSP7增强LPS刺激后chMyD88介导的免疫反应。(5)抑制USP7活性导致机体对沙门氏菌的感染更加敏感。为了阐明USP7的体内功能,我们利用USP7小分子抑制剂P5091建立了USP7活性缺陷小鼠和雏鸡模型,腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌后结果显示USP7灭活小鼠存活时间更短、死亡率更高,更容易感染鼠伤寒沙门氏菌。与对照组相比,雏鸡和小鼠的肝脏载菌量均显著降低,免疫因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达也显著降低。上述结果表明USP7去泛素化活性的失活导致机体先天免疫反应减弱。综上所述,本研究首次发现了MyD88 K48类型去泛素化酶-USP7,USP7通过促进其去泛素化进而提高MyD88蛋白稳定性,同时发现抑制USP7活性会导致机体先天免疫反应的减弱、抗病力降低。

关键词： USP7 MyD88 去泛素化细胞因子先天免疫