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泛素特异性蛋白酶25调节Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制

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泛素特异性蛋白酶25调节Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制

作者：钟会娟华中农业大学

学位级别：硕士

病毒感染可以激活宿主的免疫系统,包括天然免疫防御系统和获得性免疫应答防御系统。天然免疫反应主要发生在病毒感染的早期且与抗病毒感染紧密相关。干扰素作为重要的抗病毒因子,可清除病毒。细胞受到病毒刺激后,经过一系列信号级联反应... 详细信息

病毒感染可以激活宿主的免疫系统,包括天然免疫防御系统和获得性免疫应答防御系统。天然免疫反应主要发生在病毒感染的早期且与抗病毒感染紧密相关。干扰素作为重要的抗病毒因子,可清除病毒。细胞受到病毒刺激后,经过一系列信号级联反应,导致干扰素产生,进一步激活下游JAK-STAT信号途径,诱导下游大量抗病毒基因的转录,最终起到抗病毒作用。泛素化作为一个重要的翻译后修饰途径,在调控病毒诱导的干扰素信号通路中起着至关重要的作用。蛋白泛素化调节是一个可逆过程,细胞中还存在一些去泛素化蛋白酶(deubiquitination enzymes, DUBs)进行逆向调节。去泛素化由DUBs介导,同样在天然免疫反应中起着重要的作用,近几年更是人们研究的热点。而泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, USPs)作为DUBs中成员最多且结构最具多样性的一类半胱氨酸酶,以其结构和功能的多样性和复杂性受到了科研界的广泛关注。近些年关于USPs的报道也层出不穷,揭示了其广泛的生物学活性。为了更加全面的了解这一家族的结构和功能特征,本研究围绕USP25的结构和功能以及其在调控干扰素信号通路中的作用进行了深入的研究,具体研究内容如下：***25负调节仙台病毒(SEV)诱导的干扰素刺激应答元件(ISRE)的激活以及干扰素刺激基因(ISGs)的表达干扰素刺激应答元件(IFN-stimulated response element, ISRE)作为干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)启动子调控区的应答元件,可以启动ISGs的转录,并在抗病毒中扮演着重要角色。本研究利用双荧光素酶的方法对54个USPs干扰之后进行筛选,发现USP25显著增强仙台病毒(Sendai virus, SEV)诱导的ISRE启动子活性。进一步超表达USP25显示其显著抑制SEV诱导的ISRE启动子活性,且呈剂量依赖性。Real-Time RT-PCR结果表明USP25显著抑制多种ISGs的转录。表明USP25参与抗病毒天然免疫反应。***25负调控Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制双荧光素酶以及Real-Time RT-PCR结果显示USP25显著下调SEV诱导的p干扰素(interferon-β, IFN-β)转录。进一步干扰USP25之后发现USP25表达下调显著激活SEV诱导的IFN-β转录,表明USP25负调控SEV诱导的干扰素表达。干扰素表达需要干扰素调节因子3(interferon regulatory factor3, IRF3)与核因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)的活化以及共同作用。双荧光素酶检测结果显示USP25显著抑制SEV诱导的IRF-3以及NF-κB的激活。Western blot结果发现USP25同时抑制IRF-3以及p65的磷酸化。提示USP25通过抑制SEV诱导的IRF-3以及NF-κB的激活抑制IFN-β产生。***25去泛素化活性检测及其去泛素化活性位点的鉴定USP25虽然属于DUBs中的成员,但并不是所有的DUBs都具有去泛素化活性。经纯化或者体内表达的USP25均能将K48或K63连接形式的泛素从泛素化蛋白上移除,表明USP25存在去泛素化活性。USPs含有保守的半胱氨酸盒(Cys-box)和组氨酸盒(His-box),与天冬氨酸/天冬酰胺(Asp/Asn)一起构成起催化作用的三联残基。通过氨基酸序列比对推测USP25的第178位C(半胱氨酸)以及第607位H(组氨酸)为其去泛素化活性位点。为了验证这一推测,进一步构建了USP25突变体(C178A、H607A)的真核表达质粒,Western blot检测结果证实第178位C(半胱氨酸)以及第607位H(组氨酸)确实为USP25的去泛素化活性位点。***25的去泛素化活性参与其抑制Ⅰ型干扰素信号通路双荧光素酶研究发现USP25丧失DUB活性后,其抑制IFN-P活性显著丧失,表明USP25的DUB活性参与其抑制SEV诱导的IFN-p转录。USP25显著抑制甲酸诱导基因I(retinoic acid-induced gene-I, RIG-I)、β-干扰素启动子刺激物1(interferon-β promoter stimulator1, IPS-1)、TNF受体相关因子2(TNF receptor-assciated factor, TRAF2)以及TNF受体相关因子6(TNF receptor-assciated factor, TRAF6)等干扰素调节蛋白激活的干扰素表达。免疫共沉淀实验发现

关键词：泛素特异性蛋白酶USP25 去泛素化 β干扰素

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GIT2参与NF-κB信号通路的负调控

GIT2参与NF-κB信号通路的负调控

作者：黄晓碧安徽医科大学

学位级别：硕士

核转录因子NF-κB(NF-κB)在炎症、免疫、细胞应激和凋亡中扮演重要的角色。NF-κB经典途径的激活依靠其抑制亚基IκBα的磷酸化,而IκBα是由一个大分子量的多聚复合物调节的,即IκB激酶复合体。IKK激酶复合体是由两个催化亚基IKKα和... 详细信息

核转录因子NF-κB(NF-κB)在炎症、免疫、细胞应激和凋亡中扮演重要的角色。NF-κB经典途径的激活依靠其抑制亚基IκBα的磷酸化,而IκBα是由一个大分子量的多聚复合物调节的,即IκB激酶复合体。IKK激酶复合体是由两个催化亚基IKKα和IKKβ和一个调节亚基NEMO/IKKг(NF-κB essential modulator)组成。NEMO是IKKs和NF-κB激活所必须的分子,但是它的活性机制还没有完全阐明。研究与NEMO相互作用的蛋白质对于阐明IKK激酶复合体的活化机制、NF-κB信号通路的激活机制都具有十分重要的意义。因此,我们以NEMO为诱饵,用酵母双杂交技术从胎肝文库中分离到了与NEMO相互作用的蛋白质GIT2 (GPCR-kinase interacting proteins 2),同时,我们以GIT2为诱饵,筛选到的猎物发现有4种分子直接参与NF-κB信号通路激活的调控,包括NEMO、TRAF1 ( TNF receptor-associated factor 1 )、TNFAIP3(tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3)和TNIP1(TNFAIP3 interacting protein 1)。 GITs蛋白是近年来发现的具有脚手架功能的一类蛋白质,它们在细胞骨架的形成,膜的转运等过程中都具有重要的功能,并且作为多种信号传导通路的接头分子,前期实验表明,GIT2与NF-κB信号通路中许多关键的蛋白分子具有相互作用,我们推测GIT2有可能参与NF-κB信号通路,因此,我们以GIT2基因为主要研究对象,发现与之相互作用的蛋白,探讨其影响NF-κB的分子机制。我们采用PCR技术构建了NEMO、GIT2的原核表达载体和A20、TRAF1、TNIP1的真核表达载体及GIT2的截短体,并检测其在原核细胞和真核细胞中均表达相应的蛋白。在过表达的情况下,我们利用免疫沉淀实验确证GIT2与NEMO、TRAF1和TNIP1具有相互作用;且GIT2与NEMO相互作用的位点可能是GIT2的ARFGAP、PBS结构域和NEMO的CC结构域,确定了GIT2(1-347 aa)与TRAF1存在相互作用。GST pull-down实验表明GIT2与NEMO存在相互作用。我们通过转录活性实验发现,在过表达的情况下,GIT2、A20、TRAF1和NEMO均可以抑制NF-κB的转录活性,并且A20、TRAF1均可以和GIT2协同抑制NF-κB的转录活性;而TNIP1却可以促进NF-κB的转录活性。GIT2可以抑制TRAF2介导的NF-κB的转录活性,但不可以抑制IKKβ诱导的NF-κB的转录活性。利用GIT2、A20和NEMO内源抗体检测了细胞中GIT2、A20和NEMO的表达,发现HEK293细胞中有GIT2、A20和NEMO的表达,并用Western blot和RT-PCR的方法检测了在HEK293细胞中A20siRNA和GIT2siRNA具有一定的干涉效果。通过复合体实验表明,GIT2可以促进A20与NEMO的结合。另外,我们在HEK293细胞中过表达和敲减GIT2发现GIT2可以促进A20使NEMO发生去泛素化,进而调控NF-κB的下游靶基因的转录。但GIT2调控NF-κB的分子机制还需要进一步的确证。总之,我们筛选到的NEMO的相互作用蛋白GIT2在NF-κB信号通路中起重要的作用, GIT2作为一种新的调节NF-κB信号通路的分子,为研究NF-κB的调控机制提供了新的线索。

关键词： NF-κB 蛋白质相互作用 GIT2 去泛素化

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抗肿瘤新靶点USP7及其抑制剂的研究进展

中国药物化学杂志 2013年第6期23卷 486-492+498页

作者：宋洁梅温小安孙宏斌中国药科大学新药研究中心

泛素-蛋白酶体系统(UPS)的失控与肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等疾病密切相关,以该系统为导向的药物研发已逐渐引发关注,其中蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万珂)作为抗肿瘤药物已成功上市。泛素特异性蛋白酶7(USP7)是UPS中的一种关键性酶... 详细信息

泛素-蛋白酶体系统(UPS)的失控与肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等疾病密切相关,以该系统为导向的药物研发已逐渐引发关注,其中蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万珂)作为抗肿瘤药物已成功上市。泛素特异性蛋白酶7(USP7)是UPS中的一种关键性酶,作为去泛素化酶参与细胞内肿瘤抑制、DNA修复及免疫应答等过程中诸多重要蛋白的活性调控。本文介绍泛素特异性蛋白酶7及其抑制剂,强调泛素特异性蛋白酶7抑制剂在抗肿瘤治疗中的潜在应用价值。

关键词：泛素泛素化去泛素化 USP7 抑制剂肿瘤

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BAP1及其对透明细胞肾细胞癌的抑制作用

遵义医科大学学报 2019年第5期42卷 594-601页

作者：吴莹李学英潘有福遵义医科大学医学遗传学教研室暨贵州省基因检测与治疗特色重点实验室贵州遵义563099

肾癌在泌尿系统肿瘤中位居第三,其中约有80%的肾癌是透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)。BAP1(BRCA1-associated protein 1)是一个重要的肿瘤抑制因子,通过去泛素化作用发挥多方面的功能,如参与转录调控、表观... 详细信息

肾癌在泌尿系统肿瘤中位居第三,其中约有80%的肾癌是透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)。BAP1(BRCA1-associated protein 1)是一个重要的肿瘤抑制因子,通过去泛素化作用发挥多方面的功能,如参与转录调控、表观遗传调控、DNA损伤修复等。最近,研究发现体细胞BAP 1突变可能促成ccRCC细胞中程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-Ligand 1,PD-L1)的表达。本文综述了BAP1的结构功能及BAP 1突变在ccRCC发生发展中的作用的相关进展,以期深入了解ccRCC的发生发展机制。

关键词： BAP1 透明细胞肾细胞癌去泛素化

泛素羧基末端水解酶在生殖细胞发生及受精过程中的作用

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生殖与避孕 2014年第12期34卷 1004-1008,1014页

作者：吴比孙兆贵复旦大学上海医学院上海200032 国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室上海市计划生育科学研究所上海200032

泛素羧基水解酶UCHL1和UCHL3在哺乳类动物神经退变、生殖细胞发生与受精,以及肿瘤发生过程中具有重要作用。本文对UCHL1和UCHL3在精子发生与成熟、卵母细胞发生和受精过程中的作用进行了综述,并通过绘制图谱作了归纳。UCHL1和UCHL3具有... 详细信息

泛素羧基水解酶UCHL1和UCHL3在哺乳类动物神经退变、生殖细胞发生与受精,以及肿瘤发生过程中具有重要作用。本文对UCHL1和UCHL3在精子发生与成熟、卵母细胞发生和受精过程中的作用进行了综述,并通过绘制图谱作了归纳。UCHL1和UCHL3具有不同的底物特异性,参与生精过程中正常的细胞凋亡调控和卵母细胞发育过程中的减数分裂调节,并通过不同的途径影响精卵识别和结合而抑制多精受精。UCHL1可以与Ptov1,CDK1以及Jab1结合,初步用于解释其作用的分子机制。目前报道的UCH家族成员主要包括UCHL1和UCHL3,对其它家族成员的研究尚待开展,特别是各成员之间的进化关系,以及彼此的结构和功能差异等都需要进一步研究阐明。

关键词：泛素羧基末端水解酶(UCH) 卵母细胞精子细胞泛素化去泛素化

蛇床子素增强TNF-α对骨肉瘤细胞凋亡诱导活性及机制研究

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浙江中西医结合杂志 2016年第11期26卷 984-987页

作者：王锦军浙江省金华市中心医院儿一科金华321000

目的观察蛇床子素增强肿瘤坏死因子对骨肉瘤细胞的凋亡能力及其机制。方法将骨肉瘤细胞系HOS分为对照组、TNF-α组及蛇床子素联合TNF-α组和蛇床子素+TNF-α+CYLD si RNA组;MTT法检测HOS细胞的细胞活力,Annexin V/PI染色检测HOS细胞的凋... 详细信息

目的观察蛇床子素增强肿瘤坏死因子对骨肉瘤细胞的凋亡能力及其机制。方法将骨肉瘤细胞系HOS分为对照组、TNF-α组及蛇床子素联合TNF-α组和蛇床子素+TNF-α+CYLD si RNA组;MTT法检测HOS细胞的细胞活力,Annexin V/PI染色检测HOS细胞的凋亡,免疫共沉淀联合Western blot法检测HOS细胞RIP1蛋白的泛素化,Western blot法检测HOS细胞caspase-8的活化和CYLD去泛素化酶的相对表达量。结果与对照组比较,TNF-α组、蛇床子素+TNF-α组对HOS细胞活力的抑制率增加[(12.5±0.9)%、(58.6±3.8)%比0,P泛素蛋白相对表达量降低(0.28±0.02比1.00±0.07、0.81±0.06,P化的caspase-8蛋白的相对表达量明显提高(0.46±0.04比0.01±0.01、0.08±0.02,P泛素蛋白相对表达量增加(0.77±0.05比0.28±0.02,P去泛素化酶CYLD的表达水平,促进TNF-α依赖的RIP1蛋白的去泛素化,进而诱导骨肉瘤细胞caspase-8的活化和凋亡的发生。

关键词：骨肉瘤蛇床子素 TNF-α RIP1 去泛素化 caspase-8 细胞凋亡

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泛素-蛋白酶体系统的结构、作用和调控机制

科技通报 2008年第1期24卷 29-34页

作者：金伟军姚祥春吕美巧张礼星浙江工业大学生物与环境工程学院杭州310014

应激是指机体对外界或内部的各种刺激所产生的非特异性应答反应。泛素通过泛素-蛋白酶体途径在应激蛋白的降解过程中发挥重要作用,从而使生物体适应各种胁迫并对之产生抗性。对泛素-蛋白酶体系统作用机理及其基因分子结构的阐明,将有助... 详细信息

应激是指机体对外界或内部的各种刺激所产生的非特异性应答反应。泛素通过泛素-蛋白酶体途径在应激蛋白的降解过程中发挥重要作用,从而使生物体适应各种胁迫并对之产生抗性。对泛素-蛋白酶体系统作用机理及其基因分子结构的阐明,将有助于途径特异性位点抑制剂的设计,本文介绍了泛素-蛋白酶体系统的组成结构、作用机理和调控机制。

关键词：泛素蛋白酶体蛋白酶解去泛素化

泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)的分子进化分析

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生物信息学 2017年第4期15卷 207-213页

作者：张瑜孙兆贵复旦大学上海医学院上海200032 国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室(上海市计划生育科学研究所) 上海200032

泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)是一种去泛素化酶,特异性表达于脑与生殖腺,具有去泛素化活性、稳定细胞内泛素单体的功能。为确定UCHL1在脊椎动物中是否普遍存在,从而选择身体构造更简单的模式动物研... 详细信息

泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)是一种去泛素化酶,特异性表达于脑与生殖腺,具有去泛素化活性、稳定细胞内泛素单体的功能。为确定UCHL1在脊椎动物中是否普遍存在,从而选择身体构造更简单的模式动物研究其生物学功能,通过生物信息学手段分析脊椎动物门的11种生物中基因UCHL1的分子进化情况,分析显示UCHL1基因组长度在进化过程中变化较大,但外显子个数变化较小,蛋白氨基酸残基数目也基本维持在223 aa左右。分析结果表明,mRNA有不同的剪接方式,但氨基酸序列在进化上是高度保守的,UCHL1蛋白活性位点同源性高达90%,该结果证明了蛋白UCHL1的功能对于物种正常生存是必须的。

关键词： UCHL1 去泛素化进化保守性同源性

BRCC36的生物学功能及在心血管疾病中的研究进展

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中华临床医师杂志（电子版） 2015年第2期9卷 79-82页

作者：朱华江龚开政张振刚扬州大学第二临床医学院心血管内科江苏省225001

BRCC36是2003年从BRCC复合物中发现的一种亚基,该蛋白参与了蛋白酶体的活性、DNA修复调控、细胞信号转导及细胞周期控制等多种细胞生理过程,在肿瘤形成、血管生成、心肌保护中发挥重要作用。本文综述BRCC36结构功能以及在心血管疾病中... 详细信息

BRCC36是2003年从BRCC复合物中发现的一种亚基,该蛋白参与了蛋白酶体的活性、DNA修复调控、细胞信号转导及细胞周期控制等多种细胞生理过程,在肿瘤形成、血管生成、心肌保护中发挥重要作用。本文综述BRCC36结构功能以及在心血管疾病中的研究进展。

关键词： DNA修复心脏病 BRCC36 去泛素化