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去泛素化酶OTUB2通过诱导DDX54活性增加中性粒细胞外诱捕网的形成以及促进结直肠癌细胞活力和侵袭能力

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安徽医科大学学报 2024年第3期59卷 463-472页

作者：蒋良君李卫南华大学衡阳医学院附属南华医院消化内科衡阳421002 南华大学衡阳医学院附属南华医院肝胆外科衡阳421002

目的探讨含OTU结构域的泛素醛结合蛋白2(OTUB2)影响RNA解螺旋酶54(DDX54)的活性及其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和结直肠癌(CRC)细胞活力、侵袭的影响。方法分离CRC患者和健康对照组的外周血中性粒细胞,并使用佛波酯(PMA)或脱... 详细信息

目的探讨含OTU结构域的泛素醛结合蛋白2(OTUB2)影响RNA解螺旋酶54(DDX54)的活性及其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和结直肠癌(CRC)细胞活力、侵袭的影响。方法分离CRC患者和健康对照组的外周血中性粒细胞,并使用佛波酯(PMA)或脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)刺激中性粒细胞4 h;Western blot检测NETs标记物髓过氧化物酶(MPO)和瓜氨酸组蛋白H3(Cit-H3)的表达;干预SW480细胞中OTUB2或DDX54的表达并将其和中性粒细胞共培养,细胞分为如下组:对照组(不做任何处理),NETs组、vector组、OTUB2组、NETs+si-OTUB2组(SW480细胞、转染了vector、OTUB2过表达质粒和si-OTUB2的SW480细胞分别与PMA处理的中性粒细胞共培养),OTUB2+DNaseⅠ组(转染了OTUB2过表达质粒的SW480细胞与DNaseⅠ处理的中性粒细胞共培养),si-OTUB2组、OTUB2+si-NC组和OTUB2+si-DDX54组(转染了si-OTUB2、OTUB2过表达质粒和si-NC、OTUB2过表达质粒和si-DDX54的SW480细胞分别与中性粒细胞共培养)。ELISA检测SW480细胞上清液中MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3的浓度;MTT和Transwell检测SW480细胞活力和侵袭能力;RNA测序筛选OTUB2调控的下游基因并使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫共沉淀(co-IP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和纯化(GST-pull-down)、His-tag pull-down实验验证DDX54和OTUB2的相互作用。结果与健康对照相比,CRC患者外周血中NETs的形成增加。与对照组相比,NETs组CRC细胞活力和侵袭增加(P去泛素化酶OTUB2可以通过上调DDX54的增加NETs的形成并促进CRC细胞活力和侵袭。

关键词：去泛素化 OTUB2 DDX54 中性粒细胞胞外诱捕网结直肠癌中性粒细胞

泛素连接酶和去泛素化酶在阿尔茨海默病中的研究进展

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生命科学 2024年第5期36卷 629-636页

作者：黄颖李雪高伟康兴宇李虹霖黑龙江中医药大学研究生院哈尔滨150040 黑龙江中医药大学附属第二医院哈尔滨150001

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病。泛素化和去泛素化过程失调导致蛋白质异常聚集是AD发生发展的主要原因。E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3s)调控底物蛋白的泛素化,可促进β淀... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病。泛素化和去泛素化过程失调导致蛋白质异常聚集是AD发生发展的主要原因。E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3s)调控底物蛋白的泛素化,可促进β淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)和过度磷酸化Tau蛋白的清除,改善突触及神经元的功能。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)去除底物蛋白的泛素化修饰,可抑制Aβ和过度磷酸化Tau蛋白的降解,引起神经炎症。因为E3s和DUBs并不通过单一途径来促进或者抑制AD的发生发展,所以本文以E3s和DUBs所属亚族为切入点,综述了E3s和DUBs在AD中作用机制的最新研究进展。

关键词：阿尔茨海默病 E3泛素连接酶去泛素化酶泛素化去泛素化

去泛素化酶USP10通过稳定Smurf1抑制TGF-β/BMP信号通路

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生物化学与生物物理进展 2023年第4期50卷 760-769页

作者：张新李洪昌汪思应张令强安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所国家蛋白质科学中心(北京)北京102200

目的探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法利用GEO2R和Metascape对Usp10+/+和Usp10-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析,使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子... 详细信息

目的探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法利用GEO2R和Metascape对Usp10+/+和Usp10-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析,使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子的表达情况;进一步利用免疫印迹检测该信号通路,并通过基因芯片和免疫组化分析候选分子的表达情况;使用免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pull down实验验证USP10与候选分子的相互作用,通过泛素化实验明确USP10对底物分子的调控机制;利用免疫印迹检测细胞增殖、凋亡相关蛋白p21、Cleaved-caspase 3的表达情况,使用CCK-8和克隆形成实验分析USP10对细胞增殖的影响。结果 Usp10-/-新生小鼠肾组织中TGF-β/BMP通路激活,USP10在小鼠体内缺失后导致Smad泛素相关因子1 (Smurf1)蛋白质水平降低,Smad1/5蛋白质水平上调,却不影响它们的转录水平;机制上,USP10与Smurf1存在相互作用,并依赖其去泛素化酶活性去除Smurf1多聚泛素化。Usp10敲除后促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21表达上调,并抑制细胞的增殖能力。结论 USP10通过去泛素化并稳定Smurf1,抑制TGF-β/BMP信号通路,从而维持小鼠组织器官和细胞增殖稳态。

关键词： USP10 Smurf1 Smad1/5 去泛素化细胞增殖

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泛素化在调控铁死亡中的作用

生物化学与生物物理进展 2024年第6期51卷 1269-1283页

作者：曹灿陶永光石颖中南大学肿瘤研究所长沙410078

铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性的新的细胞死亡方式,越来越多的证据表明,铁死亡与各种病理状态有关,如神经退行性疾病、糖尿病肾病、癌症等,脂质过氧化驱动的铁死亡可能促进或抑制这些疾病的发生发展,细胞中抗氧化系统通过抑... 详细信息

铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性的新的细胞死亡方式,越来越多的证据表明,铁死亡与各种病理状态有关,如神经退行性疾病、糖尿病肾病、癌症等,脂质过氧化驱动的铁死亡可能促进或抑制这些疾病的发生发展,细胞中抗氧化系统通过抑制脂质过氧化在抵抗铁死亡过程中发挥着重要作用。铁死亡的关键通路有以SLC7A11-GPX4为关键分子的氨基酸代谢通路、以铁蛋白或转铁蛋白为主的铁代谢通路,以及脂质代谢通路。铁死亡的发生受到细胞内蛋白质的调节,这些蛋白质会发生各种翻译后修饰,包括泛素化修饰。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内主要降解系统之一,通过酶促级联反应催化泛素分子标记待降解蛋白,随后由蛋白酶体识别并降解目标蛋白质。UPS根据其降解底物的不同在调节铁死亡的反应中发挥双重作用。UPS通过促进铁死亡关键分子(如SLC7A11、GPX4、GSH)以及抗氧化系统成分(如NRF2)的泛素化降解从而促进铁死亡,也可以通过促进脂质代谢通路中相关分子(如ACSL4、ALOX15)的泛素化降解从而抑制铁死亡。本综述介绍泛素化修饰在调控铁死亡进程中作用的最新研究进展,总结了已发表的关于E3泛素连接酶和去泛素酶调控铁死亡的研究,归纳了泛素连接酶、去泛素酶调控铁死亡的作用靶点,有助于确定人类疾病中新的预后指标,为这些疾病提供潜在的治疗策略。

关键词：铁死亡泛素化去泛素化脂质过氧化

SFTSV介导的固有免疫应答及其通过抑制宿主蛋白泛素化修饰实现免疫逃逸的调控机制

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病毒学报 2024年第1期40卷 183-196页

作者：王佳敏时小双杨诗寒金宁一李昌杜寿文黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广州510640 中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元中国农业科学院长春兽医研究所长春130122 人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室武汉430030

发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)感染可造成发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)。SFTS重症患者大多与SFTSV引起非正常的固有固有免疫反应所导致的细胞因子风暴有关。这些早期固有固有免疫反应包括多种炎症和抗病毒基因的表达,并激活随后的固有固有免疫反应和适应性免疫。感染细胞的早期固有固有免疫反应是由模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)、接头蛋白、激酶和转录因子组成的细胞内信号通路所介导的。这些途径受复杂的翻译后修饰网络的严格调节,其中大量的泛素化酶和去泛素化酶使这些修饰可逆且高度动态。这些酶的调控作用可以增强固有免疫反应以抵抗病原体的入侵,也可以抑制其过度活化以避免病理性免疫反应。本文综述了SFTSV引起的早期固有免疫信号通路及其复杂调控机制,为后续针对SFTSV的药物开发和免疫病理学提供了基础。

关键词：新型布尼亚病毒固有免疫 IFN-Ⅰ型信号通路泛素化去泛素化

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乙型肝炎表面抗原泛素化修饰的研究进展

世界华人消化杂志 2024年第5期32卷 333-338页

作者：牛安行刘锦朱传武苏州市第五人民医院苏州大学附属传染病医院感染、肝病科江苏省苏州市215131

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者体内存在的大量亚病毒颗粒可以诱导免疫耐受,导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持续感染.患者要实现功能性治愈的目标,则需要获得血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen... 详细信息

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者体内存在的大量亚病毒颗粒可以诱导免疫耐受,导致乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持续感染.患者要实现功能性治愈的目标,则需要获得血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的消失,但目前临床上尚缺乏有效抑制HBV共价闭合环状DNA的有效药物,因此HBsAg很难被清除.蛋白质的泛素化修饰是HBsAg降解的一条潜在路径,这将有可能改变HBV的生存和免疫环境.本文重点对有关HBsAg的泛素化,包括类泛素化和去泛素化的研究进行综述,以期为CHB抗病毒治疗探索新的途径提供参考.

关键词：乙型肝炎表面抗原泛素化类泛素化去泛素化

去泛素化酶USP3通过稳定A3G抑制HIV-1复制的机制研究

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去泛素化酶USP3通过稳定A3G抑制HIV-1复制的机制研究

作者：赵思敏吉林大学

学位级别：硕士

逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到... 详细信息

逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到逃避宿主免疫杀伤的目的。天然免疫蛋白APOBEC3G(A3G)具有广谱抗病毒作用,为了拮抗A3G的抗病毒活性,HIV-1的病毒辅助蛋白Vif在分子伴侣CBF-β的作用下招募Cul5-Elo B-Elo C最终形成E3泛素连接酶复合物,将底物A3G泛素化,并使其被蛋白酶体途径降解,进而帮助病毒实现免疫逃脱。蛋白质的泛素化作为一种高度可逆的过程,可以与去泛素化在体内形成动态平衡,是常见的蛋白质翻译后修饰的一种。被认为是病毒感染,肿瘤、神经退行性疾病等许多重大疾病的重要药物靶标。去泛素化酶(DUB)可切割连接的泛素分子之间或泛素与修饰蛋白之间的肽或异肽键,逆转蛋白命运。作为最大的DUB亚家族,USPs主要通过其去泛素酶活性在抗病毒固有免疫反应和病毒触发的凋亡等方面调节病毒感染,USPs在HIV-1感染中的重要作用有待阐明。本研究中,我们探讨了去泛素化酶USP3通过稳定A3G对HIV-1复制的抑制作用及分子机制,主要包括以下内容:1.USP3以胞苷脱氨酶A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制。我们的研究发现在有内源A3G的H9细胞系中,USP3可以显著抑制HIV的复制,而在无内源A3G的Jurkat细胞中则病毒复制无明显变化。据此我们推测USP3以A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制;在不含有内源性A3G的HEK293T细胞中共转染野生型HIV-1、USP3和A3G,增加USP3表达可以上调A3G的蛋白水平,增强了A3G抗HIV的能力。2.USP3通过拮抗Vif诱导A3G泛素化来稳定A3G。为了探究USP3对于A3G的调节是否与Vif相关,在HEK293T中共转染A3G、Vif及USP3后,Vif诱导的A3G降解明显得到恢复。共转染Vif缺陷的HIV-1以及USP3、A3G和Vif发现USP3过表达上调了A3G蛋白水平,HIV-1病毒量低于对照组。Co-IP结果表明,USP3通过特异性的移除A3G的多聚泛素化来抑制Vif诱导的A3G泛素化及降解,而不是通过破坏Vif与Cul5、Elo B/C和CBF-β之间的相互作用。3.USP3通过酶活依赖和非酶活依赖途径实现对A3G的稳定。为了探究USP3抑制Vif诱导A3G降解是否依赖酶活,本实验构建了锌指结构域ZNF及含有酶活中心的UCH截短体。共转染及IP结果表明:USP3 WT和UCH都可以通过特异性去泛素化A3G来稳定其表达。同时,不具有酶活性中心的ZNF区域也可以稳定A3G的表达,由此猜测USP3促进A3G表达是否有其他非酶活依赖的途径。在表达内源性A3G的Hep G2细胞中,我们还观察到USP3截短体在蛋白水平和m RNA水平都显著增加了A3G的表达。即USP3直接通过稳定A3G m RNA水平来增加A3G的表达。进一步结果表明,USP3特异性地促进了A3家族成员在蛋白质和m RNA水平的表达,而不影响同为宿主限制性因子的SAMHD1和HLTF的蛋白及m RNA水平,即USP3特异性地促进A3蛋白家族的表达。体内IP结果也表明USP3可以与A3G m RNA结合从而稳定A3G的表达。这些结果表明,USP3可能通过调节或剪接A3G m RNA而影响A3G的表达。4.USP3作为抗病毒因子具有广谱性。因为A3G具有广谱抗病毒作用,USP3通过增加A3G的表达能够抑制肠道病毒EV71及CA16的复制。且HIV-1感染者CD4+T细胞中USP3的表达水平与HIV-1感染的进程有关。综上:我们证明了去泛素化酶USP3通过依赖酶活和非依赖的方式稳定A3G表达抑制HIV-1复制,揭示抗病毒因子USP3在宿主与病毒相互作用中的新功能,USP3-A3G去泛素化体系有望成为抗病毒治疗的新靶点。

关键词： USP3 APOBEC3G HIV-1Vif 去泛素化

去泛素化酶USP9X通过稳定Snail1调控三阴性乳腺癌转移和化疗敏感性

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去泛素化酶USP9X通过稳定Snail1调控三阴性乳腺癌转移和化疗敏感性

作者：梁慧暨南大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:乳腺癌(Breast Cancer)是女性最常见癌症,也是肿瘤死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌的15%-20%,具有侵袭性强、转移性高、易复发和预后差的特点。目前临床上治疗TNBC的主要手段是化疗,但治疗后期经常... 详细信息

研究背景与目的:乳腺癌(Breast Cancer)是女性最常见癌症,也是肿瘤死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌的15%-20%,具有侵袭性强、转移性高、易复发和预后差的特点。目前临床上治疗TNBC的主要手段是化疗,但治疗后期经常出现耐药和转移而导致治疗失败。有研究表明Snail1在TNBC中高表达,且与雌性激素受体α的表达呈显著负相关,提示Snail1可能作为治疗TNBC转移和耐药的靶点。去泛素化酶USP9X在不同癌症中显示出不同的功能,且多项研究证明USP9X与肿瘤对药物的敏感性有关。本研究对TNBC细胞中Snail1进行了质谱分析,发现了USP9X是其新的互作蛋白。因此本课题旨在细胞和动物水平上,探究USP9X与Snail1在TNBC中是否存在某种机制,来调控TNBC的转移和化疗敏感性。实验方法:质谱分析和免疫共沉淀实验验证USP9X与Snail1是否互作。慢病毒系统构建稳定株和Western blotting检测敲低或抑制USP9X是否影响Snail1的蛋白水平。使用蛋白酶体抑制剂MG132或CHX实验验证USP9X是否能稳定Snail1的蛋白水平。泛素化实验检测Snail1的泛素化是否受USP9X的调控。细胞迁移、侵袭和小鼠肺转移实验,验证USP9X是否通过Snail1影响TNBC细胞的迁移、侵袭和转移。细胞存活测定实验和裸鼠皮下瘤模型,验证USP9X是否通过Snail1调控TNBC对化疗药物的敏感性。实验结果:实验结果显示:USP9X与Snail1相互作用;敲低USP9X或者抑制USP9X活性能够下调Snail1蛋白水平;USP9X去泛素化并稳定Snail1;敲低USP9X或者药理抑制USP9X活性,抑制了TNBC细胞的迁移、侵袭和转移;USP9X通过Snail1调控TNBC对化疗药物的敏感性。结论:本研究证明USP9X去泛素化并稳定Snail1,从而调控TNBC细胞迁移、侵袭和转移,并调控TNBC对化疗药物的敏感性。

关键词：三阴性乳腺癌 Snail1 化疗敏感性转移去泛素化 USP9X

去泛素化酶USP5通过稳定LSH调控肝癌铁死亡的研究

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去泛素化酶USP5通过稳定LSH调控肝癌铁死亡的研究

作者：闫博康中南大学

学位级别：硕士

研究背景:肝癌因其高复发和高转移的特点,死亡率位居所有癌症中的第三位,然而目前其具体的发生发展机制尚未阐明。铁死亡是一种与代谢相关且受调节的细胞死亡形式,其异常功能与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关,探究肝癌细胞铁死亡... 详细信息

研究背景:肝癌因其高复发和高转移的特点,死亡率位居所有癌症中的第三位,然而目前其具体的发生发展机制尚未阐明。铁死亡是一种与代谢相关且受调节的细胞死亡形式,其异常功能与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关,探究肝癌细胞铁死亡的具体调节机制,对肝癌的临床诊治工作具有重大意义。表观调节因子在癌细胞的铁死亡进程中发挥关键调控作用。课题组前期研究表明:染色质重塑蛋白LSH在肺癌及白血病中可通过抑制铁死亡促进癌症发生发展,但其在肝癌中与铁死亡之间的关系目前尚不清楚。去泛素化酶可从蛋白质底物中去除泛素,靶向调节癌症进展的关键通路分子,与癌症的发生发展密切相关。多项研究表明LSH在多种癌症中高表达并与患者不良预后正相关,但其在癌症中高表达的分子机制鲜有研究涉及。研究目的:探究去泛素化酶翻译后水平修饰LSH,进而调节肝癌细胞铁死亡,影响肝癌进程的分子机制。研究方法:首先对LSH进行质谱分析,发现与其存在相互作用的去泛素化酶USP5,接着利用相关性分析、免疫荧光和Co-IP探究USP5与LSH两者间是否存在相互作用。随后构建稳定过表达或敲除USP5的肝癌细胞系,采用CHX及MG132对其进行处理,并进行体内去泛素化实验,探究USP5是否可去泛素化修饰LSH。进一步结合生信分析、Western blot及免疫组化分析检测USP5及LSH在肝癌中的表达水平及其对肝癌患者预后的影响。然后利用稳定过表达或敲除USP5的肝癌细胞系,通过一系列生物学功能实验探究USP5对肝癌细胞增殖、迁移、克隆形成和皮下致瘤性的影响,并通过形态学观察、细胞存活比例测定、lipid ROS和总GSH检测等实验研究USP5在调节铁死亡中所起的作用。随后在敲除USP5的肝癌细胞系中回复LSH,通过生物学功能实验及铁死亡关键指标检测等实验探究USP5是否通过调控LSH,影响肝癌进程及肝癌细胞铁死亡水平。最后利用USP5抑制剂Degrasyn,通过体内泛素化、CCK8、迁移、克隆形成和流式细胞术等实验检测Degrasyn对肝癌恶性进展及肝癌细胞铁死亡水平的影响。研究结果:(1)USP5与LSH相互结合,且可通过去泛素化作用稳定LSH;USP5和LSH均在肝癌中高表达且与患者预后负相关。(2)USP5通过稳定LSH促进肝癌细胞的增殖、迁移、克隆形成及皮下成瘤能力;USP5通过稳定LSH抑制肝癌细胞铁死亡发生;Degrasyn可通过靶向USP5促进肝癌细胞铁死亡以抑制肝癌进展。研究结论:USP5去泛素化修饰LSH,进而起到抑制肝癌细胞铁死亡,促进肝癌发生发展的作用。同时USP5抑制剂Degrasyn可促进肝癌细胞铁死亡,从而抑制肝癌进展,提示USP5可作为肝癌治疗的潜在新靶点。图24幅,表7个,参考文献86篇

关键词：肝癌 USP5 LSH 铁死亡去泛素化