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禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）rDNA-ITS序列异质性分析

禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）rDNA-ITS序列异质性分析

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作者：季蕾山东农业大学

学位级别：硕士

小麦纹枯病又称小麦尖眼点病(Wheat sharp eyespot),是分布地域广泛的土传性真菌病害,几乎遍及世界各温带小麦种植地,且危害范围呈逐年扩大的趋势。小麦纹枯病的病原为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis),该菌在自然和人工条件下都难以... 详细信息

小麦纹枯病又称小麦尖眼点病(Wheat sharp eyespot),是分布地域广泛的土传性真菌病害,几乎遍及世界各温带小麦种植地,且危害范围呈逐年扩大的趋势。小麦纹枯病的病原为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis),该菌在自然和人工条件下都难以产生无性或有性态的孢子,且细胞核为同质核还是异质核,目前尚无定论。这都严重制约着该病菌的分子遗传学和相关致病机制的研究。禾谷丝核菌的rDNA-ITS异质性虽有报道,但对其异质性规律及原因尚未详细探讨。本研究利用三株地理来源不同的禾谷丝核菌为供试材料,采用原生质体制备技术,获得原生质体再生菌落(single-protoplast isolate,SPI),对多个再生菌落的ITS区进行测序,利用相关生物信息学软件对ITS多序列进行比对分析,寻找禾谷丝核菌ITS序列多态性的变化规律,并探究ITS序列多态性是否与R.cerealis细胞核异质性有关。主要研究结果如下:1.通过原生质体制备技术,成功获得供试菌株WK-207、WK-137、WK-159的多个SPIs,分别为42、8、4。利用PDA培养基分别对不同的SPIs进行25℃恒温培养,并利用4’,6’二氨基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylidole,DAPI),进行细胞核荧光染色,观察核相。结果显示,SPIs与原始菌株在菌落形态、菌丝形态以及核相等方面均无差异。2.本研究从来自3个原始菌株的54个SPIs菌株中共获得169条ITS序列,其中WK-207菌株共获得89条,WK-137菌株共获得50条,WK-159菌株共获得30条。分析结果表明,来自三株不同菌株的SPIs的ITS序列在长度、GC含量以及单核苷酸多态位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)的位置及类型上均存在差异;对来自同一菌株的SPIs的ITS序列进行分析,发现这种差异既发生在同一菌株的不同SPIs菌株间,也存在于同一SPIs的不同ITS序列拷贝之间。3.对ITS多序列比对发现,ITS1区与ITS2区存在不同的变异速率。在禾谷丝核菌WK-207、WK-137、WK-159中,ITS2区存在的单核苷酸多态位点数量普遍多于ITS1区,即ITS2区变异频率大于ITS1区;相较于ITS2区,ITS1区却更容易发生碱基的插入或缺失,即片段长度多态性;就碱基变异类型而言,碱基转换的频率明显高于碱基颠换的频率。4.为进一步探究ITS区序列的多态性与禾谷丝核菌细胞核异质性的关系,本研究以WK-207所得的89个ITS序列进行比对分析,结果发现89条ITS序列绝大部分聚集于系统进化树两端,且遗传距离相对较远,被明显分为两组。因此,ITS区序列的异质性可能与禾谷丝核菌细胞核的异质性存在相关性。5.利用DNAMAN 8.对ITS序列进行一致性分析,结果发现三个供试菌株的ITS区序列相似性均高达99%以上。依据rDNA-ITS序列构建Neighbor-Joining系统发育树,结果表明169条ITS序列均聚集于AG-DI融合群分支,与其它双核丝核菌的融合群存在较远的遗传距离。因此,虽然禾谷丝核菌的ITS序列存在异质性,但依然具有较高的一致性,而且不影响利用ITS序列进行丝核菌的融合群鉴定,甚至在区分融合亚群方面,ITS序列依然具有较高的准确度。本研究利用原生质体制备技术分析了禾谷丝核菌ITS区序列的异质现象,不同菌株其多态性变化的位点不同,同一菌株其多态性位点的变化也具有一定的规律性,同一菌株ITS区序列的变化与禾谷丝核菌细胞核的异质性有明显的相关性,但禾谷丝核菌ITS区序列的变化并不影响其在融合群甚至融合亚群的划分中的应用。

关键词：禾谷丝核菌 ITS 异质性原生质体制备及再生

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阿维链霉菌基因重组菌株的选育

阿维链霉菌基因重组菌株的选育

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作者：杜翠娇河北科技大学

学位级别：硕士

随着人们生活水平的提高,国际上和国内的消费者对于化学农药造成的直接或间接的危害越来越重视。阿维菌素作为生物农药的一种,是迄今为止人类发现的最有效的杀螨杀虫抗生素。阿维菌素的的发酵是一个好氧的生物过程。传统工业的微生物... 详细信息

随着人们生活水平的提高,国际上和国内的消费者对于化学农药造成的直接或间接的危害越来越重视。阿维菌素作为生物农药的一种,是迄今为止人类发现的最有效的杀螨杀虫抗生素。阿维菌素的的发酵是一个好氧的生物过程。传统工业的微生物发酵使用深层高密度的发酵罐,溶氧常常成为发酵产品产量的重要限制性因素。本研究通过将含有透明颤菌血红蛋白基因的质粒转化到阿维链霉菌中,从而改善阿维链霉菌的供氧条件,促进阿维链霉菌的生长以及提高阿维菌素的产量。本文重点考察了影响阿维链霉菌原生质体的制备和再生的因素。首先,通过对阿维链霉菌发酵过程中定点取样,用菌体干重法测得了阿维链霉菌的生长曲线。以此确定原生质体制备的菌丝体最佳培养时间为60 h。在培养基中加入浓度为0.25 g/ml甘氨酸。溶菌酶的浓度为2 %,在34℃恒温条件下酶解30 min。在此条件下形成的原生质体的量最大为6.4×10个/ml。采用双层平板涂布法,将制备的原生质体涂布于加有0.2 %的MgCl·6HO缓冲剂的再生培养基上。涂布的密度为每个平板不多于1000个原生质体。在此条件下得到最高再生率为21.6 %。成功构建了从大肠杆菌到链霉菌的穿梭质粒。使透明颤菌血红蛋白基因能成功的转化到阿维链霉菌中。并检测出抑制阿维链霉菌原生质体再生的硫链丝菌素浓度最低为0.5μg/ml。通过对比出发菌株的发酵效价,证明了透明颤菌血红蛋白在阿维链霉菌中成功表达。从而,有效的提高了阿维链霉菌的生长及产抗生素的能力。

关键词：阿维菌素透明颤菌血红蛋白原生质体制备及再生转化溶氧

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