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重组可溶性人IL-6的原核表达纯化和活性鉴定

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现代免疫学 2013年第6期33卷 464-468页

作者：刘彩艳赵自叶郑娟段树燕郭怀祖徐进王皓上海交通大学药学院上海200240 聊城大学药学院聊城252000 第二军医大学肿瘤研究所上海200433

使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定。以人激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目... 详细信息

使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定。以人激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目的蛋白。细菌裂解上清经镍金属螯和层析纯化,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,western blot鉴定其免疫原性,并通过IL-6依赖的细胞株T1165分析重组蛋白的活性。成功构建了pET32a(+)/IL-6表达载体,并获得了可溶性表达的重组人IL-6蛋白。SDS-PAGE显示,其分子量约为21kD,可被抗IL-6抗体特异性识别,并且该重组蛋白可刺激IL-6依赖的细胞株T1165增殖,比活性与标准品一致,约为1×106 U/mg。本实验获得了可溶性高表达的重组人IL-6蛋白,为进一步研究人IL-6奠定了基础。

关键词： IL-6 原核表达纯化活性鉴定

钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备

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钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备

作者：韩雷上海交通大学

学位级别：硕士

肝脏是人体最大的消化器官，主要负责维持新陈代谢的正常进行。由于肝脏参与食物消化这一特殊功能，使其极易发生病变，引起包括急性肝衰和肝脏纤维化等发病率和死亡率都较高的疾病的发生，从而引起人们的重视。通过CCl4诱导的小鼠急... 详细信息

肝脏是人体最大的消化器官，主要负责维持新陈代谢的正常进行。由于肝脏参与食物消化这一特殊功能，使其极易发生病变，引起包括急性肝衰和肝脏纤维化等发病率和死亡率都较高的疾病的发生，从而引起人们的重视。通过CCl4诱导的小鼠急慢性肝损伤模型和基因芯片等技术手段，我们深入探讨了肝脏损伤修复的原理和机制，从而获得治疗肝损伤的全新思路和药物靶点。其中S100家族随着肝脏损伤修复过程呈现的规律性的表达变化，使其成为我们的重点研究对象。本论文以S100家族为切入点，主要包括两部分的研究内容：重组人S100A4的原核表达纯化及活性测定和S100A6单克隆抗体的制备。 S100A4是S100蛋白家族的成员，在细胞的增殖，分化，损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用。本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上，利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4。通过试验证明，重组人S100A4蛋白在体外可以有效的增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖。重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究，并且对于S100蛋白家族其他蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义。并且可用于后期对肝脏纤维化模型的药效和药理研究。为了制备抗人S100A6的单克隆抗体，利用原核表达纯化后所得纯度>97%的hS100A6为抗原，与弗氏佐剂相结合免疫Balb/c小鼠。利用杂交瘤技术，处死免疫小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤。采用Elisa检测，并用有限稀释法筛选出分泌特异抗人S100A6抗体的杂交瘤细胞株。腹腔注射同种小鼠诱导腹水产生,并应用Protein G亲和层析法进行抗体纯化。采用单克隆抗体可变区VH和VL基因组测序，为抗体可变区分区;通过Elisa、WesternBlot鉴定该单克隆抗体。结果获得2株可稳定分泌小鼠抗人S100A6的单克隆抗体，分别命名为5-1G，8-6G。Elisa和Western Blot分析表明该2株单抗均能特异性识别hS100A6。最终成功制备了2株鼠抗人S100A6蛋白的单克隆抗体，为建立S100A6蛋白检测奠定了基础。并且可用于后续S100A6中和抗体调节肝脏纤维化的药理学研究。

关键词：肝纤维化 S100家族 S100A4 原核表达纯化单克隆抗体

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7 的克隆和原核表达纯化

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中国畜禽种业 2021年第5期17卷 43-45页

作者：付强郭妍婷杨莉史慧君新疆农业大学动物医学学院 830052

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MB... 详细信息

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。

关键词：牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7 基因克隆原核表达纯化

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

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农业生物技术学报 2016年第10期24卷 1482-1490页

作者：罗维玉胡永浩张杰王金光朱鹏阳梁立滨周圆李呈军姜丽陈化兰甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70%;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一。本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类... 详细信息

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70%;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一。本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)(A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01(H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析。首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得c DNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用Bam HⅠ和NotⅠ双酶切将其定向插入p GEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达。该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出。为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析。结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90%以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好。研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料。

关键词：禽流感病毒 NS1蛋白原核表达纯化热稳定性

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MERS冠状病毒核衣壳蛋白原核表达和纯化

军事医学 2015年第12期39卷 919-922页

作者：付洋波胡勇黄成成白圆圆邱立红曹诚高婷军事医学科学院生物工程研究所北京100850

目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建... 详细信息

目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建克隆的正确性,然后将重组质粒转化进大肠杆菌BL21a(DE3)中,并在大肠杆菌BL21a(DE3)中大规模诱导表达NP蛋白,使用AKTA纯化系统经强阳离子交换层析纯化出NP蛋白。结果测序和小量诱导结果表明,扩增的NP蛋白片段序列正确,所构建的p ET-22b+-NP克隆可在大肠杆菌BL21a(DE3)的包涵体和细胞质中表达;通过阳离子交换层析和浓缩后,蛋白的纯度和浓度都得到明显提高。结论纯化出高纯度、高浓度的NP蛋白,为NP蛋白功能性研究提供重要基础。

关键词：冠状病毒属 MERS-Co V N 原核表达纯化阳离子交换层析

鼠伤寒沙门氏菌STM1697蛋白的原核表达及纯化

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中国病原生物学杂志 2017年第2期12卷 125-127,131页

作者：刘燕李鹏岳盈盈宋楠楠林玮秦立增李冰清山东省医学科学院基础医学研究所山东济南250000 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东济南250062

目的原核表达并纯化沙门氏菌毒性相关蛋白STM1697,为其功能研究奠定基础。方法以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)基因组为模板,PCR扩增STM1697基因,双酶切后连接到原核表达载体pGL01中。将阳性重组子转化入大肠埃希菌BL21(DE3)以IPTG诱导,表... 详细信息

目的原核表达并纯化沙门氏菌毒性相关蛋白STM1697,为其功能研究奠定基础。方法以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)基因组为模板,PCR扩增STM1697基因,双酶切后连接到原核表达载体pGL01中。将阳性重组子转化入大肠埃希菌BL21(DE3)以IPTG诱导,表达产物经镍离子亲和柱进行纯化,并用SDS-PAGE分析鉴定蛋白及纯度。结果成功将STM1697基因克隆到原核表达载体pGL01中。STM1697蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)以可溶形式表达,经镍离子亲和柱纯化后得到的蛋白纯度>95%。结论伤寒沙门氏菌STM1697蛋白在大肠埃希菌中可稳定表达,为其功能研究奠定了基础。

关键词：伤寒沙门氏菌 STM1697蛋白原核表达纯化

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李斯特细菌hlyA的原核表达与纯化

哈尔滨医科大学学报 2014年第2期48卷 124-127页

作者：韩乐高志贤宁保安孙志勇中国军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津300050

目的构建李斯特细菌毒力基因原核表达质粒,并诱导其表达纯化并鉴定目的蛋白。方法构建李斯特溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的原核表达载体PGEX/3X,并利用Factor Xa切割了GST标签,酶切正确后构建重组原核表达质粒,并转化到大肠杆菌,IPTG... 详细信息

目的构建李斯特细菌毒力基因原核表达质粒,并诱导其表达纯化并鉴定目的蛋白。方法构建李斯特溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的原核表达载体PGEX/3X,并利用Factor Xa切割了GST标签,酶切正确后构建重组原核表达质粒,并转化到大肠杆菌,IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blot鉴定。结果目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因GenBank登陆的序列完全一致,重组质粒经IPTG诱导表达相对分子量为60 kD的目的蛋白;Western blot鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗LM抗体特异性结合。结论成功构建了重组原核表达质粒,并纯化获得高纯度的LLO蛋白。

关键词：李斯特菌 hlyA 原核表达纯化

野生型和突变型乳腺癌标志基因C35蛋白的原核表达和纯化

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中华诊断学电子杂志 2015年第1期3卷 1-5页

作者：尹昆赵桂华寇景轩李琛琛黄炳成魏庆宽闫歌山东省医学科学院山东省寄生虫病防治研究所济宁272033

目的构建野生型和C112S突变型乳腺癌标志基因C35的原核表达载体,使其在原核细胞中高效表达、纯化并予以鉴定。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增野生型和突变型C35基因,将其分别插入原核表达载体p GLO1中,构建重组融合蛋白表达载体野生型p GL... 详细信息

目的构建野生型和C112S突变型乳腺癌标志基因C35的原核表达载体,使其在原核细胞中高效表达、纯化并予以鉴定。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增野生型和突变型C35基因,将其分别插入原核表达载体p GLO1中,构建重组融合蛋白表达载体野生型p GLO1-C35和突变型p GLO1-C35,转化大肠杆菌*** BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达C35融合蛋白,并对诱导条件进行优化,通过镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变型C35融合蛋白,经蛋白质印迹法验证纯化的重组蛋白特异性。结果成功构建了野生型和突变型C35基因的原核表达质粒,并将两种C35融合蛋白成功表达,最佳诱导表达条件为37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导6 h,经纯化后获得高纯度的特异性重组蛋白,浓度达约1.5 mg/m L。结论在原核表达系统中成功表达、纯化了野生型和突变型C35融合蛋白,为进一步制备基于C35抗血清的乳腺癌早期筛查试剂盒奠定了基础。

关键词： C35基因基因肿瘤原核表达纯化乳腺肿瘤诊断

小鼠抗棉铃虫硫酸酯酶(HaSulf1)多克隆抗体的制备与鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2021年第10期37卷 936-941页

作者：李雪古丽·库尔班张龙马小丽新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室新疆乌鲁木齐830046

目的原核表达棉铃虫硫酸酯酶1(HaSulf1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法构建原核表达载体,诱导表达,用镍柱纯化重组蛋白,注射免疫小鼠。采血后用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot法检测其免疫特异性。结果获得重组质粒,诱导表达得... 详细信息

目的原核表达棉铃虫硫酸酯酶1(HaSulf1)蛋白,制备其多克隆抗体。方法构建原核表达载体,诱导表达,用镍柱纯化重组蛋白,注射免疫小鼠。采血后用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot法检测其免疫特异性。结果获得重组质粒,诱导表达得到融合蛋白并成功纯化。ELISA实验检测获得的多克隆抗体效价最高可达到1∶819200。Western blot结果显示该抗体能与体外表达重组蛋白及棉铃虫体内的天然硫酸酯酶结合。结论原核表达获得重组HaSulf1蛋白并制备了特异性的小鼠多克隆抗体。

关键词：棉铃虫棉铃虫硫酸酯酶1(HaSulf1) 原核表达纯化多克隆抗体免疫特异性