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流式细胞术检测胱氡肽酶3原位激活与两种检测细胞凋亡方法的比较性研究

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中华检验医学杂志 2004年第9期27卷 582-585页

作者：冯永东陶德定谢大兴钟以胜李小兰肖薇余源吴剑宏胡俊波龚建平华中科技大学同济医学院肿瘤研究所分子医学中心武汉430030

目的　用一种新的荧光染色技术 (FLICA/PI)检测放射诱导T淋巴细胞白血病细胞(MOLT 4 )的细胞凋亡过程中胱氡肽酶 3(Caspase 3)原位激活及探讨其活性变化特点 ,并与亚G1峰和膜联蛋白V/碘化丙啶 (AnnexinV/PI)检测细胞凋亡方法的灵敏度进... 详细信息

目的　用一种新的荧光染色技术 (FLICA/PI)检测放射诱导T淋巴细胞白血病细胞(MOLT 4 )的细胞凋亡过程中胱氡肽酶 3(Caspase 3)原位激活及探讨其活性变化特点 ,并与亚G1峰和膜联蛋白V/碘化丙啶 (AnnexinV/PI)检测细胞凋亡方法的灵敏度进行比较性评价。方法　以放射诱导的MOLT 4细胞凋亡为模型 ,用荧光标记的Caspase 3抑制剂 (FLICA)标记原位激活的Caspase 3,然后 ,用流式细胞仪定量检测并分析其活性变化 ;同时 ,用亚G1峰法和AnnexinV/PI检测细胞凋亡。结果　FLICA/PI检测到的Caspase 3激活 ,在照射后 2h开始升高 (5 84 % ) ,而AnnexinV/PI在 4h时检测到的凋亡率为 5 35 % ,FLICA/PI比AnnexinV/PI可提前 2h检测到细胞凋亡 ,Caspase 3活性的出现早于细胞膜反转。FLICA阳性率在照射后 4h暴发性增高至 12 39% ,显示有时间效应。两种检测方法均比亚G1峰法敏感 ,但AnnexinV/PI检测的凋亡率低于FLICA/PI法。结论　X 射线能诱导MOLT 4细胞凋亡 ,并有明显的时间效应关系 ;Caspase 3激活有阈值效应 ,是照射后细胞发生凋亡过程中早于形态学变化的检测指标。用Caspase 3活性检测细胞凋亡更直接 ,更敏感。

关键词：细胞凋亡 Caspase3 原位激活 PI 凋亡率比较性研究放射诱导肽酶 MOLT-4 荧光标记

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自体神经干细胞原位激活与缺血性脑损伤

中华神经外科杂志 2003年第6期19卷 476-478页

作者：张波王任直姚勇中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院神经外科北京100730

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，已经成为当今第二大致死疾病及首位致残原因~[1]其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，虽然对其机制的了解越来越深人，但有效的治疗手段仍然缺乏二对于大多数脑缺血患者，神经... 详细信息

缺血性脑血管病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，已经成为当今第二大致死疾病及首位致残原因~[1]其病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，虽然对其机制的了解越来越深人，但有效的治疗手段仍然缺乏二对于大多数脑缺血患者，神经元死亡不可避免，是治疗难以取得满意效果的主要原因。近年来，己经从胚胎及成年的脑组织分离出具有自我更新、能够分化成神经元和神经胶质细胞的神经干细胞（neural stem eell，NSC）。因为NSC能促进神经元再生及损伤脑组织恢复，许多学者开始研究NSC移植对脑缺血的治疗作用，并取得了一定进展，但由于免疫排斥及技术操作等方面问题，限制了其应用。脑缺血可激活自体NSC原位增殖，通过某些手段可放大其治疗作用，从而达到自身修复。

关键词：自体神经干细胞原位激活缺血性脑损伤兴奋性氨基酸神经营养因子激素

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脑缺血再灌注神经干细胞原位激活的研究

卒中与神经疾病 2003年第6期10卷 329-332页

作者：刘玲玉曾庆杏武汉大学人民医院神经内科研究生430060

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间、不同脑部位神经干细胞(NSC)原位激活的变化规律。方法建立一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记脑内增殖细胞,免疫组化(SP法)技术检测大鼠缺血再灌注不同时间段缺... 详细信息

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间、不同脑部位神经干细胞(NSC)原位激活的变化规律。方法建立一侧大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记脑内增殖细胞,免疫组化(SP法)技术检测大鼠缺血再灌注不同时间段缺血周边皮质、双侧侧脑室下区(SVZ)、海马齿状回下区(SGZ)具有增殖能力细胞BrdU表达变化。结果对照组脑组织双侧SVZ、SGZ可见少量BrdU阳性标记细胞;单纯脑缺血2 h组脑组织BrdU阳性细胞数未见明显增加;再灌注3天组,缺血侧皮质、双侧SVZ和SGZBrdU阳性细胞明显增多(P原位激活,且NSC增殖于缺血后1周达到高峰,激活部位以双侧SVZ、缺血侧海马和周边皮质为主。

关键词：脑缺血缺血再灌注神经干细胞原位激活 5-溴脱氧尿苷免疫组织化学

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内源性神经干细胞的原位激活与微环境

中国医药导报 2012年第34期9卷 39-40,43页

作者：孙灵芝庄伟端汕头大学第一附属医院神经内科广东汕头515041

研究显示,神经损伤可激活内源性神经干细胞(NSC)增殖、分化和迁移。内源性NSC的原位激活受其微环境中各种信号分子的调控。Wnt、Notch和bHLH信号途径对NSC的激活有着重要的作用。促有丝分裂因子、神经营养素可促进NSC的增殖、分化,中药... 详细信息

研究显示,神经损伤可激活内源性神经干细胞(NSC)增殖、分化和迁移。内源性NSC的原位激活受其微环境中各种信号分子的调控。Wnt、Notch和bHLH信号途径对NSC的激活有着重要的作用。促有丝分裂因子、神经营养素可促进NSC的增殖、分化,中药、针灸亦有一定的促进作用。本文对神经干细胞的生物学特性及微环境的影响加以阐述。

关键词：内源性神经干细胞原位激活微环境

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植物通用“原位激活”技术开发与应用

植物通用“原位激活”技术开发与应用

唐菖蒲伯克氏菌ATCC10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘

首届植物科学前沿学术大会

作者：姚琦沈润东田益夫张学宁朱健康陆钰明中国科学院分子植物科学卓越创新中心上海植物逆境生物学研究中心

转基因过表达是植物研究和育种极其重要的常用技术,但存在随机整合、异位表达和遗传不稳等致命缺陷。虽然基因组编辑技术发展多年,但植物上用片段敲入靶向增强目标基因表达水平的相关报道极少,各类应用的系统化研究更是空白。针对上述问... 详细信息

转基因过表达是植物研究和育种极其重要的常用技术,但存在随机整合、异位表达和遗传不稳等致命缺陷。虽然基因组编辑技术发展多年,但植物上用片段敲入靶向增强目标基因表达水平的相关报道极少,各类应用的系统化研究更是空白。针对上述问题,本研究提出了一种基于靶向敲入技术的"原位激活"方法,即在目标基因启动子区进行靶向敲入增强子,大幅提升靶基因表达。通过系统分析和挖掘,筛选了13个具有不同转录激活能力的短片段增强子。原生质体荧光素瞬时实验结果表明,其可实现5-100倍左右的大幅激活,同时激活程度与敲入位置密切相关。我们进一步采用靶向敲入技术,将上述3个增强子片段精准敲入至水稻EUI和RFT1这两个基因启动子区。在总共230株T0代植株中我们分别筛选得到了51株和11株成功敲入事件。qPCR实验表明,增强子片段的正反向敲入都可以大幅提升目标基因的表达,实现了5-200倍不同程度的激活。与预期一致,对其T2代植株的研究表明,该"原位激活"效应可100%遗传至下一代。为了进一步验证"原位激活"技术,我们对NMN代谢通路的6个关键酶(ASP、QS、QPRT、NMNAT、NADS及NAD ppase)进行原位调控,从320株T0代植株中筛选得到了120株靶向敲入植株。分别挑选8-10株后代进行转录分析,结果表明增强子的靶向敲入全都实现了不同程度靶向激活,提升幅度在3-119倍。NMN含量检测表明,其叶片中的浓度获得了不同程度提升,最高为野生型1.7倍。"原位激活"技术通过在启动子区原位敲入增强子实现目标基因表达提升,其无需基因克隆、不依赖额外转基因序列、可稳定遗传稳定激活的优势,有望代替使用了30多年的传统转基因过表达技术,大力推动植物研究和种质创新。

关键词：基因编辑靶向敲入原位激活增强子

来源： cnki会议评论

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唐菖蒲伯克氏菌ATCC10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘

作者：孙涛山东大学

学位级别：硕士

微生物天然产物结构类型复杂,生物活性多样,是临床、农业及畜牧业药物的重要来源,如抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂和抗虫药等。在过去的几十年中,放线菌一直是微生物天然产物的主要来源。随着基因测序技术的发展,研究者从一直被忽视的... 详细信息

微生物天然产物结构类型复杂,生物活性多样,是临床、农业及畜牧业药物的重要来源,如抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂和抗虫药等。在过去的几十年中,放线菌一直是微生物天然产物的主要来源。随着基因测序技术的发展,研究者从一直被忽视的伯克氏菌中挖掘到越来越多的活性天然产物。基于“Red/ET重组工程”的多种微生物重组酶系统和基因簇异源表达平台的建立,为微生物天然产物的挖掘提供了有力的技术支撑。本研究聚焦于唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli)ATCC 10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘,首先建立ATCC 10248的遗传操作体系,利用该体系对6个未知的NRPS基因簇进行原位激活和失活,成功激活两个基因簇,得到多个新型脂肽类化合物;并利用Red/ET重组工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。主要研究结果如下:建立*** 10248的遗传操作体系。首先测定常用抗生素对ATCC 10248的最低抑制浓度,结果表明,卡那霉素、安普霉素和庆大霉素可用于菌株遗传操作过程中的抗性筛选。然后对来源于大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)嗤菌体和伯克氏菌(Burkholderiales)的三种重组酶系统gbaA、gBAS和Redγ-Redαβ7029,通过基因敲除实验进行重组效率比较,结果表明,来源于***噬菌体的gBAS重组酶系统只需50 bp的同源臂即可介导ATCC 10248体内高效的同源重组。原位激活*** ATCC 10248中的未知基因簇BGC2和BGC5,得到多个新型脂肽类化合物。首先利用gBAS重组系统对ATCC 10248中6个未知的NRPS基因簇进行强启动子插入激活和基因插入失活修饰,成功激活BGC2和BGC5。然后通过硅胶柱层析初步分离及HPLC制备,从BGC2的激活突变株中分离到5个代谢产物(化合物1、3、5,混合物2、6),从BGC5的激活突变株中分离到2个代谢产物(化合物7和9),通过核磁共振光谱鉴定了以上产物的结构,并通过HRMS/MS分析及同位素标记底物喂养实验推测了 4和8的结构,均为新型脂肽类化合物。利用Red/ET重组工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。由于利用gBAS重组系统未能将BGC7成功原位激活,因此利用Red/ET重组工程对BGC7进行直接克隆,并将基因簇的启动子替换为组成型强启动子Pgenta,随后在*** GB05-MtaA、*** E264、Burkholderiales DSM 7029 等多个异源宿主中表达,但仍未激活成功。原因可能在于次级代谢产物生物合成基因簇在微生物体内受到复杂的级联调控,仅通过单一的激活方法无法激活级联反应中的其他步骤。

关键词：唐菖蒲伯克氏菌非核糖体肽原位激活直接克隆异源表达

假交替单胞菌隐性次级代谢产物挖掘体系的构建

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假交替单胞菌隐性次级代谢产物挖掘体系的构建

作者：马梅娜山东大学

学位级别：硕士

微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样,使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来,多重耐药细菌的流行... 详细信息

微生物天然产物及其衍生物为心血管疾病、癌症、细菌和病毒感染等疾病的治疗以及农业生产上的杂草、害虫等防治作出了很大贡献。他们的结构、生物活性及作用机制复杂多样,使其在新型药物开发中具有重要地位。近年来,多重耐药细菌的流行,对新型抗生素等药物的研发提出了更高的需求,然而天然产物出新率低,近几十年来被应用于临床的抗生素中仅有少数具有新骨架。海洋中蕴藏着丰富的生物资源,其独特的低温低氧高盐高压环境使海洋微生物通过次级代谢等产生抗逆作用,从而使代谢产物的合成、结构和活性更加新颖。变形杆菌作为海洋中微生物的主要分布类群,能够产生许多具有抗菌、抗病毒、抗生物膜、防污和抗癌活性的天然产物,是活性天然产物的主要来源之一。基因组学和代谢组学分析发现海洋微生物基因组上具有大量隐性次级代谢产物的生物合成基因簇,激活这些隐性合成途径进一步挖掘海洋微生物代谢潜力对于新型天然产物的发现及新药开发具有重要意义。本研究聚焦于海洋变形杆菌金黄色假交替单胞菌Pseudoalteromonas flavipulchra S16中新型活性天然产物的挖掘。对*** S16进行代谢组学和基因组学分析,发现除已知化合物alterochromides的生物合成途径外,基因组上有13个未知天然产物的生物合成基因簇,且大多与已知基因簇的相似度较低,具有合成新型天然产物的潜力。利用ExoCET技术对新颖的沉默基因簇BGC8(40 kb)进行直接克隆和修饰,导入三种异源宿主 *** GB05-MtaA、*** KT2440和*** DSM 7029 中表达,但未检测到新化合物产生。因此,我们通过单交换重组对*** S16基因组上的沉默基因簇进行原位激活,将两种启动子Palt和Pery分别插入BGC8核心基因上游,但仍未产生新的产物。然后我们对菌株S16进行了转录组测序,对内源型强启动子进行了活性分析和筛选,并将其用于沉默基因簇的原位激活。对不同培养时间点的*** S16进行转录组测序,选择33个转录水平位于前3.3%的基因上游的启动子作进一步分析。分别将33个内源启动子亚克隆到自杀载体pR6K-attP-phiC31-fluc上,并整合在荧光素酶报告基因fluc上游。同时通过单交换重组及SacB反向筛选将attB位点整合到菌株S16基因组上已知化合物alterochromides生物合成基因簇的核心区域,在引入attB位点的同时对alterochromides生物合成途径进行了失活,以构建荧光素酶基因定点整合且代谢背景较低的突变菌株。之后将带有不同启动子和fluc基因的质粒转入菌株S16,通过PhiC31整合酶介导attB与attP的位点特异性重组将启动子筛选质粒整合到基因组上。然而,由于PhiC31定点整合系统在菌株S16中效率非常低或不能工作,只获得了含有P7启动子的质粒通过启动子区域的单交换重组整合到基因组上的重组菌株。于是将带有启动子和fluc基因的自杀质粒的pR6K复制子替换为可复制的pBR322复制子并通过接合转移将质粒导入*** S16中,荧光素酶活性测定表明启动子P7、P18、P29和P32具有较高的活性。为了进一步验证内源启动子的有效性,本研究通过单交换重组和SacB反向筛选将P7启动子插入*** S16基因组上7个沉默基因簇的上游,包括4个PKS/NRPS杂合基因簇 BGC1、BGC3A、BGC8、BGC7 和 3 个 NRPS 基因簇 BGC2、BGC3B、BGC9。对发酵粗提物进行HPLC-MS分析发现BGC9被成功激活,产生了多个新化合物,化合物的结构、生物活性和生物合成机制有待进一步研究。本研究利用启动子筛选和基因组编辑,在*** S16中成功建立了隐性次级代谢产物的挖掘体系,为*** S16和其他海洋细菌的活性次级代谢产物挖掘提供了有效的途径。

关键词：天然产物假交替单胞菌异源表达启动子筛选原位激活