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神经元单层细胞电镜原位包埋方法的探讨

中国细胞生物学学报 2016年第12期38卷 1512-1517页

作者：潘立君何苗张宾张芳吴亮亮孔妤中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所神经科学国家重点实验室电镜技术平台上海200031

为探究神经元单层细胞电镜原位包埋方法,该研究以体外培养的大鼠皮层神经元单层细胞为材料,采用了三种不同的方法进行样品制备。结果表明,常规悬浮离心包埋法容易对细胞造成机械损伤,且无法保持原位性;培养在玻璃盖玻片上的细胞,虽能保... 详细信息

为探究神经元单层细胞电镜原位包埋方法,该研究以体外培养的大鼠皮层神经元单层细胞为材料,采用了三种不同的方法进行样品制备。结果表明,常规悬浮离心包埋法容易对细胞造成机械损伤,且无法保持原位性;培养在玻璃盖玻片上的细胞,虽能保持较好的原位性,但其超薄切片表层易破碎,遇水溶解,且在透射电镜下可见细胞整体衬度弱和超微结构不完整;而培养在Thermanox塑料薄膜盖玻片上的细胞,可容易观察到相邻细胞间的紧密连接,超微结构清晰,衬度较前组样品好,三维重构之后可很好地显示神经元细胞之间的毗邻关系。因此,相比前两种细胞制样方式,Thermanox塑料薄膜上单层细胞处理过程简便,成功率高。该结果为神经元细胞超微结构的形态学研究进一步提供技术新思路,并有望推动神经元细胞超微结构观察中三维重构技术和光镜/电镜联用技术的开发应用。

关键词：神经元单层细胞原位包埋塑料薄膜盖玻片电镜三维重构

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少量贴壁培养细胞电镜原位包埋方法的探讨

中国细胞生物学学报 2014年第12期36卷 1649-1651页

作者：翟楠吴轶成陈新宇易静杨洁上海交通大学医学院生物化学与分子细胞生物学系上海200025

该文探讨了对少量贴壁培养细胞较易操作且能保存较好超微结构的透射电镜样品包埋的方法。将Hela细胞分为三组:(1)不使用环氧丙烷,将树脂胶囊直接倒扣包埋于塑料培养皿;(2)不使用环氧丙烷,将细胞爬片倒扣包埋于胶囊;(3)使用环氧丙烷并将... 详细信息

该文探讨了对少量贴壁培养细胞较易操作且能保存较好超微结构的透射电镜样品包埋的方法。将Hela细胞分为三组:(1)不使用环氧丙烷,将树脂胶囊直接倒扣包埋于塑料培养皿;(2)不使用环氧丙烷,将细胞爬片倒扣包埋于胶囊;(3)使用环氧丙烷并将细胞爬片倒扣包埋于胶囊。将三组带有细胞的树脂胶囊进行超薄切片,电镜观察后发现,第一种方法包埋简便,超薄切片上无细胞缺失孔洞,且超微结构保存较好。

关键词：培养细胞原位包埋透射电镜

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体外培养细胞原位包埋电镜样品的制作方法

南京医科大学学报（自然科学版） 2013年第5期33卷 707-708页

作者：钱晶晶管怀进朱昌来南通大学附属医院眼科江苏南通226001

目的:探讨一种快速简单的单层细胞原位包埋及电镜样品的制作方法,避免离心法等对细胞造成伤害以致影响电镜下细胞结构的观察。方法:将细胞培养在盖玻片上并进行原位包埋,通过置入液氮冷却的方式迅速彻底分离树脂与玻片上的细胞层。结果... 详细信息

目的:探讨一种快速简单的单层细胞原位包埋及电镜样品的制作方法,避免离心法等对细胞造成伤害以致影响电镜下细胞结构的观察。方法:将细胞培养在盖玻片上并进行原位包埋,通过置入液氮冷却的方式迅速彻底分离树脂与玻片上的细胞层。结果:此方法所得细胞的超微结构清晰,损伤明显减少。结论:体外培养细胞原位包埋电镜样品的制作方法快速简单,对细胞伤害少,完全可以满足科研和临床病理诊断的需要。

关键词：原位包埋透射电子显微镜电镜样品制作(超薄切片)

原位包埋法在培养细胞TEM样品制备中的应用

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 1998年第S1期24卷 66-68页

作者：徐颖沈永浩付一提姜槐浙江农业大学电镜室浙江医科大学电镜室浙江医科大学微波研究室

研究了一种在透射电镜（ＴＥＭ）下可较好地显示培养细胞原位状态下细胞及其边界关系超微结构形态改变的方法，表明应用Ｆａｌｃｏｎ培养皿与ＣＨＬ细胞、ＰＡＰＧ固定液、Ｅｐｏｎ８１２包埋剂等材料，进行原位固定－原位包埋－二次定... 详细信息

研究了一种在透射电镜（ＴＥＭ）下可较好地显示培养细胞原位状态下细胞及其边界关系超微结构形态改变的方法，表明应用Ｆａｌｃｏｎ培养皿与ＣＨＬ细胞、ＰＡＰＧ固定液、Ｅｐｏｎ８１２包埋剂等材料，进行原位固定－原位包埋－二次定向包埋切片的ＴＥＭ样品制备操作法，可满足研究的需要。

关键词：原位固定原位包埋培养细胞电子显微镜

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培养平滑肌细胞原位包埋超薄切片的制备

大连医科大学学报 2010年第2期32卷 227-228页

作者：吕广艳曲淑贤高船舟吕淼赵莹高颖辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室辽宁大连116044 大连医科大学生化教研室辽宁大连116044

[目的]探讨培养平滑肌细胞透射电镜制样方法。[方法]将平滑肌细胞培养在3.5 cm的塑料培养皿上,连同培养皿一起进行固定、脱水、浸透,然后将培养皿切开,一部分倒扣包埋,另一部分切成小条,放入胶囊中包埋,聚合后超薄切片,透射电镜横向和... 详细信息

[目的]探讨培养平滑肌细胞透射电镜制样方法。[方法]将平滑肌细胞培养在3.5 cm的塑料培养皿上,连同培养皿一起进行固定、脱水、浸透,然后将培养皿切开,一部分倒扣包埋,另一部分切成小条,放入胶囊中包埋,聚合后超薄切片,透射电镜横向和纵向观察细胞的超微结构。[结果]完整保存了细胞生存状态时的超微结构;在倒扣包埋后横向切片中,细胞内有大量线粒体、内质网、微管、微丝等;纵向切片中,可见细胞连接和细胞突起。[结论]利用原位包埋超薄切片技术可以对贴壁细胞进行制样,在电镜下观察贴壁细胞超微结构。

关键词：血管平滑肌细胞原位包埋超薄切片透射电镜

PVDF中空纳米纤维的制备及其固定化酶的性能研究

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太原理工大学学报 2022年第1期53卷 36-43页

作者：刘瑞红周全杨帆吴丽杰任瑞鹏吕永康太原理工大学省部共建煤基能源清洁高效利用国家重点实验室太原030024 山西省工业与城市污水处理工程技术研究中心太原030024

利用同轴静电纺丝技术,制备了表面多孔的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纳米纤维膜,并通过在内芯纺丝液中添加多巴胺,在固定化过程中多巴胺原位聚合生成聚多巴胺,将漆酶和辣根过氧化物酶固定在PVDF中空纳米纤维的内空腔中。通过优化同轴静电纺丝... 详细信息

利用同轴静电纺丝技术,制备了表面多孔的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纳米纤维膜,并通过在内芯纺丝液中添加多巴胺,在固定化过程中多巴胺原位聚合生成聚多巴胺,将漆酶和辣根过氧化物酶固定在PVDF中空纳米纤维的内空腔中。通过优化同轴静电纺丝参数,探讨了外壳纺丝液中PVDF良溶液和不良溶液的溶剂比、纺丝温度、干燥条件对PVDF中空纳米纤维膜载体结构的影响,测试了固定化酶的中空纳米纤维的表面亲疏水性、酶的催化活性和稳定性,并分析了结构对固定化酶性能的影响。结果显示固定化酶活性保持了游离酶的80%;储存7 d后固定化酶的活性仍为初始活性的82%;进行10个反应操作后仍保持其初始活性的40%以上。研究结果表明同轴静电纺丝法制备的表面多孔的PVDF中空纳米纤维膜是酶固定化的优良载体。

关键词：同轴静电纺丝中空纳米纤维固定化酶聚多巴胺原位包埋

基于机械化学法制备酶-共价有机网络杂化材料

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基于机械化学法制备酶-共价有机网络杂化材料

作者：焦彧帅天津大学

学位级别：硕士

以酶催化为基础的绿色生物制造是缓解当今世界资源危机和能源短缺,实现可持续生产的重要途径。与化学催化过程相比,酶催化的反应条件温和,具有高催化反应效率、特异性和选择性。但是酶极易受到外部极端环境的影响而变性失活,其操作稳定... 详细信息

以酶催化为基础的绿色生物制造是缓解当今世界资源危机和能源短缺,实现可持续生产的重要途径。与化学催化过程相比,酶催化的反应条件温和,具有高催化反应效率、特异性和选择性。但是酶极易受到外部极端环境的影响而变性失活,其操作稳定性和循环性能差、回收过程困难等问题阻碍了其在催化工业中的应用。固定化酶是解决上述问题的有效策略,已经被广泛用于工业生产。本论文围绕固定化酶系统在实际应用中面临的关键问题,即方法的简便通用性、系统的稳定性和生物相容性,基于快速、简单的机械化学策略制备了酶-共价有机网络(CONs)杂化材料。系统分析了材料的形成过程,揭示了酶-载体的构效关系。利用该策略成功构建了基于CONs的酶级联纳米反应器(ECNs),实现高效的多酶级联反应,并对级联反应动力学进行了系统探究。主要研究内容总结如下:利用机械化学合成策略原位制备了酶-CONs杂化材料,实现了葡萄糖氧化酶(GOx)在CONs中的原位包埋。系统分析了材料结构及演变过程,探究了其反应机制。考察了机械化学策略对酶分子结构的影响,证明酶分子的构象得到了有效的维持。由于Tp BD-CON极强的化学稳定性及其对酶分子结构有效的约束,GOx@Tp BD-CON在极端p H、高温、有机溶剂等严苛的外界环境中具有优异的稳定性。经过6次循环反应测试后,其催化活性为初始活性的80.5%,表现出良好的循环稳定性。此外,利用该策略实现了过氧化氢酶(CAT)和辣根过氧化物酶(HRP)的原位包埋,证明Tp BD-CON可以作为一种普适性的酶固定化平台。进一步利用机械化学策略制备了基于CONs的ECNs系统,实现了GOx和HRP在CONs中的共固定。机械化学合成策略有效地维持了酶分子的构象。与单酶固定化混合系统相比,ECNs系统表现出更高的级联催化反应速率。反应起始阶段,其反应速率达到单酶固定化混合系统的3.7倍以上。系统比较了ECNs系统和单酶固定化混合系统的级联催化反应的中间产物传递机制。证实了GOx和HRP在Tp BD-CON中的共固定促进了中间产物HO的快速传递,在HRP分子周围迅速建立起高的HO局部浓度,进而加速了GOx-HRP级联催化反应。此外,通过调控ECNs中酶的比例调节了级联催化反应的物质转化过程,这对设计高效的生物级联催化反应系统具有指导意义。

关键词：机械化学共价有机网络固定化酶原位包埋多酶级联反应

非晶态共价有机框架材料固定化酶的制备及性能强化

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非晶态共价有机框架材料固定化酶的制备及性能强化

作者：吴振华天津大学

学位级别：硕士

生物酶催化是一类以酶为催化剂进行物质合成与转化的绿色催化过程,因具有反应条件温和、催化活性高、产物选择性高等优势,被广泛应用于大宗化学品、医药化学品、精细化学品的合成。然而,胞外的游离酶易受热、酸碱等因素影响而失活。模... 详细信息

生物酶催化是一类以酶为催化剂进行物质合成与转化的绿色催化过程,因具有反应条件温和、催化活性高、产物选择性高等优势,被广泛应用于大宗化学品、医药化学品、精细化学品的合成。然而,胞外的游离酶易受热、酸碱等因素影响而失活。模拟自然界细胞结构,利用多孔材料载体原位包埋酶分子,可有效提升酶分子的稳定性和回用性。但仍面临合成步骤较繁琐、载体结构不规整、载体稳定性较差等缺点。论文针对上述问题,提出了“一锅法”共沉淀制备非晶态共价有机框架材料(Tp BD-a COFs)固定化酶的方法,实现了酶分子在类规整材料内的原位包埋,制备了酶@Tp BD-a COFs,揭示了载体稳定酶结构的过程和机制,阐述了固定化酶结构-功能间内在关系,实现了CO等物质转化过程的高效强化。论文主要研究内容如下:基于“一锅法”共沉淀策略,以乙醇为分散相,通过葡萄糖氧化酶(GOD)诱导醛基与氨基间的席夫碱反应制备了GOD@Tp BD-a COFs,实现了GOD的高效负载,酶负载率达129.1μg mg。通过调控酶量,制备了具不同比表面积和孔结构的GOD@Tp BD-a COFs,考察了生长过程与结构演变规律,实现了GOD@Tp BD-a COFs的可控制备。通过调控温度、p H、光、酶抑制剂等条件,GOD@Tp BD-a COFs表现出优异的稳定性和高活性回收率,重复使用12次后仍可保留初始活性的70%以上。GOD@Tp BD-a COFs的多级结构有效降低了传质阻力,加速了底物和产物扩散,因此表现出更高的反应活性。此外,验证了Tp BD-a COFs作为多酶催化和碳捕集转化平台的应用潜力,为CO的资源化应用提供理想途径。基于溶剂工程,优化“一锅法”共沉淀策略,以水为主要分散相,以碳酸酐酶(CA)为研究对象,制备了CA@Tp BD-a COFs-1。通过调控溶剂和酶量,制备了不同形貌结构的CA@Tp BD-a COFs-1,实现了高效固定酶分子,固定化效率达88%。优化后,CA@Tp BD-a COFs-1中酶分子较好地保持了二级结构,与游离酶相比,其酶活力可达85%。Tp BD-a COFs-1的保护作用使得酶分子表现出较好的稳定性,在70 C和p H 4的环境中孵化120 min仍可保留初始活性的60%,极大拓展了生物催化剂的应用范围。此外,该生物催化系统具有优异的循环稳定性,12次循环中仍可保留初始活性的80%以上,实现高效持续的CO捕集与转化。

关键词：原位包埋非晶态共价有机框架材料碳酸酐酶 CO2捕集与转化

透射电子显微镜原位细胞或组织简便快速包埋法

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华西医科大学学报 1997年第2期28卷 229-231页

作者：杨果唐小佳基础医学院电子显微镜室

为了满足临床病理诊断及科研的需要，克服电镜原位细胞或组织包埋法之不足，作者研究出一种改良的透射电子显微镜细胞或组织原位简便快速包埋法。其特点是：①操作简便，全部包埋步骤（固定、脱水、浸泡及包埋）均在同一载体（培养瓶或... 详细信息

为了满足临床病理诊断及科研的需要，克服电镜原位细胞或组织包埋法之不足，作者研究出一种改良的透射电子显微镜细胞或组织原位简便快速包埋法。其特点是：①操作简便，全部包埋步骤（固定、脱水、浸泡及包埋）均在同一载体（培养瓶或显微镜观察的组织切片）上进行，能保存原位组织或细胞的超微结构；②快速，从固定到制备成超薄切片全过程仅需５小时；③易从载体上将包埋片分离下来，分离下来的包埋片完整，超微结构清晰。该方法不仅可用于单层培养细胞的超微结构研究，也可用于超微结构病理诊断，电镜免疫组织化学等方面的研究。文内还对该方法的操作要点进行了讨论。

关键词：原位包埋快速包埋透射电子显微镜