检索结果-南通市图书馆

色谱 2024年第7期42卷 693-701页

作者：梁富超柯弥田瑞军南方科技大学理学院化学系广东深圳518055

酪氨酸磷酸化在t细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代t细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究t细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导... 详细信息

酪氨酸磷酸化在t细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代t细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究t细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代t细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代t细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代t细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增t细胞的完整流程,第4天时t细胞数量扩增到7倍以上;其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(ti^(4+)-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代t细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含t细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ItAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAt、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代t细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。

关键词：纳升液相色谱-串联质谱酪氨酸磷酸化原代t细胞共刺激信号转导

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基于CRISPR/Cas9技术构建多重sgRNA实现在人原代t细胞中敲除ADRB2基因

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中国实验血液学杂志 2019年第5期27卷 1682-1690页

作者：孙毓刘丹施明郑骏年徐州医科大学江苏省肿瘤生物治疗研究所

目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代t细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除。方法:针对ADRB2基因5’端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载... 详细信息

目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代t细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除。方法:针对ADRB2基因5’端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载体瞬时转染HEK-293t细胞;通过t7EN I酶切检测其介导的切割效率,筛选出4条高活性的配对sgRNA。继而将4条sgRNA有序串联克隆至pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体,构建成靶向ADRB2基因的多重sgRNA表达载体。瞬时转染HEK-293t细胞后,经t7EN I酶切和tA克隆测序明确其对ADRB2基因的修饰效率及方式。通过电穿孔技术将多重sgRNA质粒与Cas9质粒导入人原代t细胞。运用流式细胞术(FCM)检测该方法对靶蛋白β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)的敲除效率。结果:t7EN I酶切和tA克隆测序分析的结果均表明,与单一sgRNA相比,多重sgRNA策略可获得更丰富的突变类型和更高的基因编辑效率。突变模式除了碱基的缺失、插入,还有大片段DNA缺失、倒位。随机送检的10个tA克隆全部发生了基因修饰,突变效率高达100%,且均出现了提前终止密码子。FCM检测发现,对照组中β2-AR阳性t细胞比例为43.09%,但转染多重sgRNA/Cas9后β2-AR的阳性表达率下降至25.61%。结论:本研究初步建立了在人原代t细胞中敲除β2-AR的技术方法,且该方法简便、可操作性强。本研究为进一步深入探索β2-AR在人t细胞抗肿瘤免疫中的作用奠定了技术基础。

关键词：基因编辑 CRISPR/Cas9 多重sgRNA 原代t细胞 ADRB2

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