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IRF3基因干扰对LPS刺激原代枯否细胞早期细胞因子分泌动态变化的影响

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中国免疫学杂志 2016年第4期32卷 470-475,479页

作者：朱彤涂文娟谈志丽刘亮明南京医科大学附属上海松江中心医院/上海交通大学附属第一人民医院松江分院感染科上海201600

目的:探讨干扰素调节因子3(Interferon regulator factor 3,IRF3)shRNA腺病毒对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激枯否细胞(Kupffer cell,KC)早期细胞因子分泌动态变化的影响。方法:采用在体灌注分离培养大鼠原代KC,以IRF3shRNA腺病毒体外感染KC,48 h后采用LPS刺激细胞,于0、2、4和6 h收集细胞培养上清液,并收集6 h细胞。上清液细胞因子的分泌采用ELISA分析;细胞IRF3基因表达采用RT-PCR和Western blot方法检测。结果:LPS刺激诱导了KC内IRF3 mRNA和蛋白质表达升高,IRF3 shRNA腺病毒的应用抑制了LPS刺激诱导和非刺激组成性IRF3 mRNA和蛋白质的表达;KC受LPS刺激活化后极早期(2 h)IFN-β分泌即上升,4 h达峰值,6 h分泌水平开始下降,但仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激后各时间点IFN-β的分泌,抑制分泌高峰的出现,并使6 h分泌水平趋于正常;KC活化后极早期即分泌大量TNF-α,并于2 h内达到峰值,随后分泌逐渐下降,但6 h仍维持于高水平。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激各时间点TNF-α的分泌,并抑制了分泌高峰的出现;IL-1β分泌增高出现于LPS刺激4 h后,6 h分泌水平达更高值。干扰腺病毒的应用抑制了LPS刺激早期KC对IL-1β的分泌;KC受LPS刺激活化后极早期IL-10分泌即上升,且随着LPS刺激时间延长,其分泌水平逐渐增加。IRF3 shRNA腺病毒的应用促进了LPS刺激后早期各时间点IL-10的分泌。结论:IRF3 shRNA腺病毒可使原代枯否细胞IRF3基因表达沉默;在LPS刺激原代KC,IRF3可促进其下游信号分子IFN-β、前炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,并抑制抑炎细胞因子IL-10分泌。因此,IRF3可能在肝组织免疫炎症性损伤的发生中起中心作用。

关键词：原代枯否细胞干扰素调节因子3 基因干扰固有免疫炎性反应

腺病毒对原代枯否细胞转染效率及增殖活性的影响

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实用医学杂志 2016年第6期32卷 879-882页

作者：朱彤涂文娟谈志丽刘亮明南京医科大学附属上海松江中心医院感染科上海市201600

目的:研究腺病毒对原代肝枯否细胞(Kupffer cell,KC)的转染效率和增殖活性影响。方法:分离纯化大鼠肝KC,并以携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的腺病毒以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染KC;24 ... 详细信息

目的:研究腺病毒对原代肝枯否细胞(Kupffer cell,KC)的转染效率和增殖活性影响。方法:分离纯化大鼠肝KC,并以携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的腺病毒以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染KC;24 h后,采用荧光显微镜和流式细胞术评估腺病毒的转染效率,以CCK-8比色法检测腺病毒对KC增殖活性的影响。结果 :经统计学处理,当病毒MOI值分别为0、100、300、500、700、900时,荧光显微镜以及流式细胞术测得不同组间GFP表达阳性细胞率均存在明显的差异(均P细胞增殖活性存在明显差异(均P细胞增殖活性无明显差异(均P>0.05)。结论 :腺病毒能够有效转染大鼠肝脏KC细胞并表达绿色荧光蛋白。且随着病毒MOI值的增加,腺病毒转染效率逐渐增加。大剂量的病毒对KC增殖活性存在不良影响。

关键词：原代枯否细胞腺病毒转染绿色荧光蛋白细胞增殖活性

在LPS刺激的枯否细胞中敲减干扰素调节因子3（IRF3）表达可影响多条信号转导通路

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第8期35卷 587-594页

作者：朱彤涂文娟谈志丽刘亮明南京医科大学附属上海市松江区中心医院 201600 上海市同济医院消化内科上海交通大学附属第一人民医院松江分院

目的：探讨 IRF3 shRNA对脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS）刺激枯否细胞（ Kupffer cell,KC） TLR4信号下游 IRF3-IFN-β、NF-κB/p38 MAPK-TNF-α/IL-1β和 IL-10分子的影响。方法采用在体灌注分离培养大鼠原代KC,并以IRF3 shRNA腺病毒体外感染KC。细胞分4组：1组：腺病毒（-）LPS（-）；2组：腺病毒（-）LPS（＋）；3组：腺病毒（＋）LPS（-）；4组：腺病毒（＋）LPS（＋）。 KC培养上清液细胞因子的分泌水平采用ELISA分析；mRNA表达采用real-time PCR检测；KC核蛋白质表达采用 Western blot方法。结果 LPS刺激诱导了原代 KC对 IRF3 mRNA和蛋白质的表达, IRF3 shRNA腺病毒应用后,细胞对IRF3 mRNA的组成性表达及LPS刺激诱导的IRF3 mRNA和蛋白质表达均明显受抑,但对IRF3蛋白质核内组成性表达无明显影响；LPS刺激枯否细胞IFN-β mRNA表达和蛋白质分泌均升高。 IRF3 shRNA应用后,抑制了上述LPS的刺激效应,但对细胞IFN-β的组成性表达和分泌无明显影响；LPS刺激诱导了细胞对前炎细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表达及蛋白质的分泌,IRF3 shRNA腺病毒的应用,抑制了LPS刺激诱导细胞TNF-α和IL-1β蛋白质分泌水平,但对LPS刺激细胞TNF-α和IL-1β mRNA表达以及细胞组成性TNF-α和IL-1β mRNA表达和蛋白质分泌无明显影响；LPS刺激后,细胞IL-10 mRNA表达和培养上清液IL-10蛋白质分泌均显著增加。 IRF3 shRNA腺病毒的应用,促进了LPS刺激诱导KC对IL-10的转录表达和分泌,但对细胞组成性IL-10表达和分泌无明显影响；LPS刺激使核内p-p65和p-p38 MAPK蛋白水平升高,但IRF3 shRNA腺病毒应用对LPS刺激细胞上述分子表达及对细胞组成性表达均无明显影响。结论干扰腺病毒能有效抑制LPS刺激原代枯否细胞IRF3表达及其下游信号转导；IRF3有助于促进LPS刺激KC对TNF-α和IL-1β分泌,但抑制LPS刺激后IL-10的表达；LPS诱导细胞NF-κB和p38 MAPK活化不受IRF3信号影响。

关键词：干扰素调节因子3 短发夹RNA腺病毒信号通路脂多糖原代枯否细胞