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雌激素受体α下调介导十溴联苯醚破坏肌动蛋白微丝束致大鼠血睾屏...

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作者：耿茜雅安徽医科大学

学位级别：硕士

目的十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether,BDE-209)是一种具有持久性和生物累积特性的环境污染物,近年来在世界各地的环境、野生动物和人体内均检测出其存在。BDE-209对人体健康主要包括神经和神经发育、免疫、胚胎、生殖、致畸性和(潜... 详细信息

目的十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether,BDE-209)是一种具有持久性和生物累积特性的环境污染物,近年来在世界各地的环境、野生动物和人体内均检测出其存在。BDE-209对人体健康主要包括神经和神经发育、免疫、胚胎、生殖、致畸性和(潜在)致癌性等损害,其中雄性生殖毒性日益受到关注。BDE-209可以破坏血液-睾丸屏障(blood-testis barrier,BTB)结构影响精子发生,但机制尚不清楚。本课题通过体内和体外实验,探讨雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)在BDE-209破坏大鼠BTB结构中的分子机制。方法体内实验使用60日龄SPF级SD雄鼠,随机分为四组(溶剂对照组,0.1 mg/kg BW BDE-209组,0.5 mg/kg BW BDE-209组,2.5 mg/kg BW BDE-209组)。大鼠染毒采用睾丸注射法,12.8天后使用颈椎脱臼法处死并取材。体外实验使用18-20日龄SPF级SD雄鼠原代睾丸Sertoli细胞。细胞培养72 h后进行BDE-209剂量和时间趋势染毒,染毒剂量分别为12.5、25、50μM,染毒时间分别为6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,筛选最适宜的染毒剂量和时间进行PPT处理。分别设五个处理组:DMSO组、PPT组、BDE-209组、BDE-209+PPT组、MPP组,染毒时间为24 h。进行以下实验:(1)为观察BDE-209对SD雄鼠和原代Sertoli细胞的毒作用,BDE-209染毒后计算大鼠睾丸脏器系数,HE染色和PAS染色法观察BDE-209睾丸注射后SD雄鼠睾丸和各期曲细精管形态学损伤,MTT试验检测不同浓度染毒组细胞活力。(2)为观察BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞中ERα表达的影响,采用qRT-PCR和WB试验检测ERαmRNA和蛋白表达。(3)为观察BDE-209染毒致SD雄鼠和原代Sertoli细胞BTB相关结构和功能改变,采用超微电镜观察大鼠睾丸BTB结构,采用qRT-PCR、WB和免疫荧光染色方法检测BTB相关蛋白的mRNA、蛋白和位置表达。(4)为阐明ERα在BDE-209破坏原代Sertoli细胞BTB结构中的作用,采用qRT-PCR、WB和免疫荧光染色方法检测ERα特异性激动剂PPT与BDE-209共处理后BTB相关蛋白的mRNA、蛋白和位置表达。结果 (1)BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞的毒作用。与对照组相比,各剂量组大鼠睾丸重量均减小(P细胞、支持细胞空泡化、长型精子嵌入内皮、间质炎性细胞浸润和各级精细胞数目减少或缺失。PAS染色可见I-XIV期各期曲细精管内均出现上述损伤。随染毒浓度和时间增加,Sertoli细胞活力逐渐下降,与对照组相比,当BDE-209浓度超过50μM时差异有统计学意义(P原代Sertoli细胞中ERα表达的影响。与对照组相比,2.5 mg/kg BW剂量组大鼠睾丸组织中ERα的mRNA和蛋白表达下降(P原代Sertoli细胞50μM和24 h、36 h、48 h染毒时ERα蛋白表达下降(P原代Sertoli细胞BTB相关结构和功能影响。BTB超微电镜显示,2.5 mg/kg BW剂量组紧密连接出现明显断裂甚至解体,肌动蛋白微丝束出现缺失,支持细胞内出现脂滴和大量空泡。动物实验中,与对照组相比,ZO1、Occludin、β-catenin和Formin1在各剂量组mRNA表达均下降(P原代Sertoli细胞中,与对照组相比,Occludin和β-catenin mRNA表达下降(P细胞表面。(4)PPT缓解BDE-209对原

关键词：十溴联苯醚雌激素受体α 血睾屏障原代支持细胞

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WDFY1在小鼠精子发生及PolyI:C诱导的睾丸炎症中的作用研究

WDFY1在小鼠精子发生及PolyI:C诱导的睾丸炎症中的作用研究

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作者：吕春雨华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】探究Poly I:C对小鼠睾丸组织、小鼠原代支持细胞和小鼠原代间质细胞炎症反应的影响。探究Poly I:C对小鼠睾丸炎症及生殖能力的影响,分析Poly I:C干预后,小鼠睾丸组织、小鼠原代支持细胞和小鼠原代间质细胞炎症相关因子的表达差... 详细信息

【目的】探究Poly I:C对小鼠睾丸组织、小鼠原代支持细胞和小鼠原代间质细胞炎症反应的影响。探究Poly I:C对小鼠睾丸炎症及生殖能力的影响,分析Poly I:C干预后,小鼠睾丸组织、小鼠原代支持细胞和小鼠原代间质细胞炎症相关因子的表达差异。【方法】（1）构建小鼠睾丸组织炎症感染模型:选择6-8周的C57BL/6J雄性小鼠,随机分成两组:对照组（Mock组）和实验组（Poly I:C组）,将Poly I:C或者等量PBS注射到小鼠睾丸内,构建相应的实验组和对照组小鼠模型,并设定不同时间点:0h、3h、6h、9h、12h、24h。利用HE染色、IHC染色和RT-q PCR方法检测感染小鼠睾丸组织的组织形态差异、炎性细胞因子的分泌情况,进而研究Poly I:C对小鼠睾丸组织的影响。（2）构建小鼠原代支持细胞和原代间质细胞炎症感染模型:选择6-8周的C57BL/6J雄性小鼠,分离原代支持细胞和原代间质细胞,用含有血清的DMEM/F12培养2-3天后,先用不含血清的培养基饥饿处理2h,之后将转染试剂与等量的Poly I:C或PBS分别处理实验组和对照组6h,然后通过RT-q PCR比较实验组和对照组TNFα,IL-1β,IFNα,IFNβ,ISG15及ISG56的表达水平。（3）通过RT-q PCR方法检测实验组与对照组的差异表达基因。尤其是TLR3信号通路相关的基因,例如:Wdfy1,Trif,Rig-1,Myd88,Mda5和Traf6等。【结果】（1）组织形态方面:与对照组相比,感染Poly I:C 6小时后,间质细胞增生,生精小管之间的间隙变大,随着感染时间的延长,到24小时,间质出现大量炎性细胞浸润,部分生精小管管腔结构不完整,生精细胞部分丢失。（2）炎性细胞因子分泌方面:与对照组相比,感染3h后小鼠睾丸、间质细胞（LCs）和支持细胞（SCs）中的TNFα,IL-1β,IFNα,IFNβ,ISG15及ISG56的表达水平开始增加,感染6h后分泌达到峰值,24h后分泌逐渐下降至正常水平。（3）信号通路方面:与对照组相比,感染后的小鼠睾丸、LCs和SCs中TLR3的m RNA表达水平增加,且感染造成的差异表达基因中,Wdfy1上调最明显。【结论】（1）Poly I:C成功激活小鼠睾丸、SCs和LCs中的TLR3信号通路,且会诱导小鼠睾丸炎症。（2）Poly I:C诱导小鼠睾丸炎症的差异表达基因中,Wdfy1上调最明显。【目的】第一部分的研究结果表明Poly I:C可以诱导小鼠睾丸组织的炎症反应,且Poly I:C的诱导会引起一些基因表达的变化,其中,Wdfy1上调最明显。因此,为了进一步探究WDFY1在Poly I:C诱导的小鼠睾丸炎症中的作用,此部分我们着重研究WDFY1蛋白在不同物种之间的氨基酸序列的保守性以及WDFY1在小鼠不同组织,尤其是睾丸组织中的表达和定位情况。【方法】通过生物信息学分析比较WDFY1不同物种之间氨基酸序列,例如人、黑猩猩、狼、黄牛、小鼠、鸡、瓜蟾和斑马鱼等物种,探究不同物种之间的WDFY1是否具有保守性;通过RT-q PCR和设计Wdfy1标签小鼠的方法研究WDFY1在小鼠不同器官以及不同类型生殖细胞和免疫细胞中的表达情况。【结果】在氨基酸水平上,不同物种之间的WDFY1氨基酸序列具有高度的保守性,其中,人源WDFY1与小鼠直系同源物约有97%的同一性。此外,WDFY1在小鼠睾丸组织中表达最高。其中,WDFY1在小鼠生殖细胞、支持细胞、间质细胞和巨噬细胞中均有表达,且在圆形精子细胞和延长型精子细胞表达最高。【结论】WDFY1在进化过程中保守性极高。且WDFY1在小鼠睾丸组织中表达最高,尤其是小鼠的圆形精子细胞和延长型精子细胞,小鼠支持细胞和间质细胞也有表达。【目的】第二部分的研究表明WDFY1在小鼠睾丸组织中高度表达,且在生殖细胞、支持细胞和间质细胞均有表达。此外,基于WDFY1是TLR3/TRIF信号通路增强剂的研究背景,在此基础上,我们重点探究WDFY1对Poly I:C诱导的小鼠睾丸炎症的影响。【方法】使用Talen系统构建全身性Wdfy1敲除小鼠模型。首先通过分析睾丸组织形态、检测精子的受精能力以及生育力检测等方法揭示生理情况下Wdfy1的敲除对雄性小鼠生殖能力的影响。其次,通过睾丸注射Poly I:C的方法建立野生型小鼠和敲除小鼠的睾丸组织感染模型。模型建立之后利用HE染色、IHC染色和RT-q PCR方法比较野生型小鼠和敲除小鼠感染后的睾丸组织形态学变化以及炎症浸润情况。最后,分离野生型小鼠和敲除小鼠的原代间质细胞和原代支持细胞,通过Poly I:C诱导相应的体外细胞感染模型,利用RT-q PCR方法检测Tnfα,Il-1β,Ifnα,Ifnβ,Isg15及Isg56的表达水平。【结

关键词： PolyI:C TLR3信号通路睾丸组织原代支持细胞原代间质细胞 WDFY1 睾丸圆形精子细胞延长型精子细胞支持细胞间质细胞精子发生睾丸炎症生育能力

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