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SPINK3促进体外培养的原代大鼠肝细胞增殖

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中国生物化学与分子生物学报 2017年第12期33卷 1280-1288页

作者：常翠芳罗亚茹郗玲玲杨婧郭建林王改平李青青王雪郭萃徐存拴河南师范大学生命科学学院河南省-科技部共建细胞分化调控国家重点实验培育基地河南新乡453007

肝病是威胁人类健康的主要疾病之一,而肝具有强大的再生能力,因此开发肝再生的药物靶标对肝病防治具有重大意义。本室前期采用大鼠全基因组芯片检测发现,丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型Ⅲ(serine protease inhibitor Kazal typeⅢ,SPINK3)... 详细信息

肝病是威胁人类健康的主要疾病之一,而肝具有强大的再生能力,因此开发肝再生的药物靶标对肝病防治具有重大意义。本室前期采用大鼠全基因组芯片检测发现,丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型Ⅲ(serine protease inhibitor Kazal typeⅢ,SPINK3)在大鼠肝再生中表达显著改变。研究表明,SPINK3是一类结构与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)相似的生长因子,能够与表皮生长因子受体(EGFR)结合促进细胞增殖。本文通过基因过表达和干涉的方法处理原代大鼠肝细胞,通过CCK8法、Ki67免疫荧光法、PI单染法和Annexin V/PI双染法检测SPINK3表达变化对原代大鼠肝细胞活力、增殖、周期和凋亡的影响。结果显示SPINK3过表达时能够显著提高原代大鼠肝细胞的细胞活力,促进其细胞周期和增殖,并抑制其细胞凋亡,而干涉SPINK3表达则显著降低原代大鼠肝细胞的细胞活力,抑制其细胞周期和增殖,并促进其细胞凋亡。以上结果表明,SPINK3能够促进体外培养的原代大鼠肝细胞的增殖,并抑制其凋亡。

关键词：丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型Ⅲ 原代大鼠肝细胞细胞周期细胞凋亡

微囊藻毒素-LR对原代大鼠肝细胞p-JNK1／2、p-P44／42、p-P38蛋白水平的影响

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环境与职业医学 2013年第5期30卷 356-359,364页

作者：钱小兰帅怡王彦琴肖萍仲伟鉴复旦大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室公共卫生安全教育部重点实验室上海200032 上海市疾病预防控制中心毒性评价科上海200336

[目的]研究低剂量微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)染毒原代大鼠肝细胞对细胞内磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK1/2)、磷酸化的细胞外信号激酶(p-P44/42)、磷酸化的P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38)蛋白水平的影响。[方法]采用改良胶... 详细信息

[目的]研究低剂量微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)染毒原代大鼠肝细胞对细胞内磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK1/2)、磷酸化的细胞外信号激酶(p-P44/42)、磷酸化的P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38)蛋白水平的影响。[方法]采用改良胶原酶灌流法建立的原代大鼠肝细胞培养模型,以MC-LR终浓度1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L 4个剂量染毒细胞,分别培养至3、6、12、24h 4个时间点后裂解细胞获取总蛋白,用Western法检测分析丝裂原蛋白激酶家族(MAPKs)磷酸化蛋白p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38水平。[结果]染毒原代大鼠肝细胞3、6h后p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38蛋白表达水平随染毒剂量降低而上升,在1×10-10或1×10-11mol/L剂量组蛋白水平达到峰值后随染毒剂量降低而蛋白水平增幅减小;染毒至12h除p-P38各剂量组蛋白水平升高外,其余目标蛋白各剂量组与对照组相比差异无统计学意义;染毒24h各目标蛋白各剂量组与对照组相比差异无统计学意义。[结论]低剂量微囊藻毒素可促进原代大鼠肝细胞p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38水平升高且具有时间效应关系。

关键词：微囊藻毒素-LR 原代大鼠肝细胞丝裂原活化蛋白激酶

低剂量微囊藻毒素对原代大鼠肝细胞促增殖效应的分子机制研究

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低剂量微囊藻毒素对原代大鼠肝细胞促增殖效应的分子机制研究

作者：钱小兰复旦大学

学位级别：硕士

随着水华污染的全球流行,人群暴露藻毒素的机会大大增高,对藻毒素的研究也受到越来越多的关注。微囊藻毒素(microcystin, MC)是由水体中的蓝藻产生的具有生物活性的单环7肽化合物,目前已发现了90余种MC的异构体。大量研究显示长期饮用... 详细信息

随着水华污染的全球流行,人群暴露藻毒素的机会大大增高,对藻毒素的研究也受到越来越多的关注。微囊藻毒素(microcystin, MC)是由水体中的蓝藻产生的具有生物活性的单环7肽化合物,目前已发现了90余种MC的异构体。大量研究显示长期饮用低浓度MC污染的水与原发性肝癌、大肠癌和胃肠道肿瘤等肿瘤的高发率有关。MC生物毒性作用的靶器官为肝脏。已有的实验研究提示,MC的毒性效应表现为剂量上的双效性,即高剂量的MC能引起细胞程序性死亡或凋亡,而低剂量的MC则具有促进细胞增殖以及肿瘤形成的效应。由于MC对人群的危害更多地集中于通过饮水或饮食长期低剂量的暴露,且越来越多的流行病学资料显示其与肿瘤发生的相关性,因此,MC的慢性毒性尤其是潜在的致癌性成为研究的热点之一。多数动物实验研究显示,MC是肿瘤发生的促长剂而非引发剂,而失控的细胞增殖是在肿瘤形成过程中至关重要。因此,研究MC的促细胞增殖效应对于阐明MC的促癌作用机制具有重要意义。课题组前期研究发现1×10-5～1×10-6mol/L的MC-LR可引起细胞凋亡的发生;而1×10-9～1×10-12mol/L的MC-LR则具有促细胞增殖的现象,表现为细胞活率增加、细胞周期中S期细胞比例增加,DNA合成速率增加。基于此,本课题继续采用原代大鼠肝脏细胞为研究模型,深入对低剂量MC-LR的促细胞增殖效应进行研究,在更早更多的时间点观察MC促细胞增殖效应及可能的分子机制,从细胞生物学与分子生物学的角度探讨MC低剂量暴露下原代大鼠肝细胞细胞周期及周期调控蛋白的变化,分析与细胞增殖密切相关的MAPK信号通路改变,为阐明MC与肝癌高发之间的关系提供实验基础和理论依据。研究发现以1×10-9～1×10-12mol/L的MC-LR染毒原代大鼠肝细胞可引起细胞增殖效应,细胞增殖效应在染毒12h即能被观察到且在1×10-11mol/L组增殖效应明显,表现为细胞活率增加、细胞周期中S期细胞比例增加。进一步研究发现,细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白水平在MC-LR染毒后(3h-6h)可观察到有增高表现,cyclin A在染毒后(6h-12h) mRNA及蛋白水平增高。MAPK家族的P44/42、JNKl/2、P38的磷酸化活性在MC-LR染毒后(3h-6h)可观察到有增高表现,MAPK下游转录因子AP-1亚基c-fos在mRNA、蛋白及其磷酸化状态三个层面活性均在MC-LR染毒后(3h-6h)观察到增高表现。c-fos蛋白及磷酸化状态高水平持续至12h,c-fos mRNA水平在12h呈下降趋势,24h c-fos各指标回复对照组水平。c-jun三个层面高表达的效应持续存在于染毒后3h-24h。各分子效应最明显在1×10-10或1×10-11mol/L剂量组,与细胞增殖效应在剂量组上重合,早于细胞增殖现象且在作用时间上相互呼应。实验结果提示细胞周期蛋白cyclin的高表达、MAPK家族蛋白磷酸化活性的增高、AP-1活性增强可能与MC-LR的促细胞增殖效应相关。

关键词：微囊藻毒素原代大鼠肝细胞细胞增殖细胞周期相关蛋白 MAPK

三叶青提取物对肝癌细胞HepG_2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用研究

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浙江预防医学 2005年第9期17卷 1-2,5页

作者：丁钢强郑军献魏克民浦锦宝浙江省疾病预防控制中心浙江省中医药研究院

目的探讨三叶青提取物对肝癌细胞HepG2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用。方法采用体外细胞培养技术,以细胞活性、细胞乳酸脱氢酶(LDH)活力的改变为指标,观察三叶青提取物对肝癌细胞HepG2,体外毒作用的时效、量效关系,共观察其对正常原代... 详细信息

目的探讨三叶青提取物对肝癌细胞HepG2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用。方法采用体外细胞培养技术,以细胞活性、细胞乳酸脱氢酶(LDH)活力的改变为指标,观察三叶青提取物对肝癌细胞HepG2,体外毒作用的时效、量效关系,共观察其对正常原代培养大鼠肝细胞的影响。结果三叶青提取物以1×10-4g/L的浓度与HepG2共同培养,在24h较空白对照组的细胞活性有显著降低;不同浓度的提取物和HepG2共同培养,乙酸乙酯提取部位对细胞活性及酶学改变有显著性影响;对原代培养大鼠肝细胞活性及LDH也有一定的影响。结论三叶青提取物对HepG2细胞具有明显的体外细胞毒作用,其毒性作用与药物的浓度和作用时间呈明显正相关,但对正常原代大鼠细胞毒性较小。

关键词： Hep G2 原代大鼠肝细胞三叶青

C市枯水期饮用水环境中的有机污染物对原代大鼠肝细胞DNA的损伤

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C市枯水期饮用水环境中的有机污染物对原代大鼠肝细胞DNA的损伤

赤豆荚果总黄酮提取物对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用

中华预防医学会首届学术年会

作者：邱志群舒为群田怀军重庆第三军医大学预防医学系环境卫生教研室

在以地面水为水源的原水与饮用水中已检测出的有机污染物已经多达几千种,其中不乏致癌、致突变物,国内外学者对此作了大量的研究。但关于水中有机提取物是否能直接损伤细胞DNA的研究仅见少量报道。本研究采用快速、灵敏的单细胞凝胶电... 详细信息

在以地面水为水源的原水与饮用水中已检测出的有机污染物已经多达几千种,其中不乏致癌、致突变物,国内外学者对此作了大量的研究。但关于水中有机提取物是否能直接损伤细胞DNA的研究仅见少量报道。本研究采用快速、灵敏的单细胞凝胶电泳检测C市的5个自来水厂的水源水与出厂水中有机提取物对大鼠肝细胞DNA的损伤,为研究水中有机提取物对人群健康的危害积累资料。结果显示5个水厂的水中有机提取物均能在一定的浓度范围内引起大鼠肝细胞DNA损伤,水源水样品中诱导DNA损伤的最低浓度A、B厂为50ml/管,C、D、E厂为250ml/管,而出厂水诱导DNA损伤的最低浓度均为250ml/管;除A厂外其余水厂的出厂水中有机提取物引起的DNA迁移长度均高于水源水,且出厂水引起损伤的剂量低于水源水;位于嘉陵江边的A、B厂水样诱导的细胞DNA损伤大于位于长江边的C、D、E厂,污染程度最轻的是位于主城区上游的C厂。该结果提示C市的水源水与出厂水均已受到有机物的污染,具有潜在的致突变活性,出厂水的DNA损伤作用大于水源水可能是由于氯化消毒时产生了有机卤代物;该结果还表明嘉陵江有机物的污染重于长江,水厂在城区的相对位置也可影响其受污染的程度。有研究表明C市的肝癌死亡率明显高于全国城市水平同时饮水类型是C市是肝脏肿瘤原发性肝癌相关程度最大的危险因素之一。结合本次实验结果提示饮用水有机物污染可能是C市的肝脏肿瘤高发的一个重要因素,水环境的治理与保护应引起高度重视。

关键词：有机提取物饮用水单细胞凝胶电泳原代大鼠肝细胞 DNA损伤

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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营养学报 2005年第5期27卷 397-400,405页

作者：李波赵青威 Nadine Weber 楼宜嘉 Peter Proksch 浙江大学药学院药理与毒理研究室 Institute of Pharmaceutical Biology H-H-University of Düsseldorf DüsseldorfGermanyD-40225

目的:探讨赤豆荚果总黄酮提取物抗氧化作用以及对培养大鼠原代肝细胞氧化损伤的保护作用。方法:采用Photochem抗氧化测定仪对赤豆荚果总黄酮提取物体外抗氧化作用进行评价,同时评价其对培养大鼠原代肝细胞Fe2+氧化损伤保护作用的量效... 详细信息

目的:探讨赤豆荚果总黄酮提取物抗氧化作用以及对培养大鼠原代肝细胞氧化损伤的保护作用。方法:采用Photochem抗氧化测定仪对赤豆荚果总黄酮提取物体外抗氧化作用进行评价,同时评价其对培养大鼠原代肝细胞Fe2+氧化损伤保护作用的量效、时效关系。结果:赤豆荚果总黄酮提取物具有较强的抗氧化作用,在40,80,120ng剂量下,抗氧化作用大于芹菜素(P原代肝细胞中加入100 μmol/L Fe2+后肝细胞活性减弱,培养液中ALT活力升高(P大鼠原代肝细胞氧化损伤具有保护作用。

关键词：原代大鼠肝细胞氧化损伤赤豆黄酮 MTT 丙氨酸氨基转移酶

苯巴比妥钠对环磷酰胺致大鼠肝细胞毒性的影响

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中国医院药学杂志 2010年第19期30卷 1652-1654页

作者：吴运生武汉工业学院医院湖北武汉430023

目的:利用原代培养正常大鼠肝细胞研究苯巴比妥钠(PNB)对环磷酰胺(CP)致离体大鼠肝细胞的毒性作用。方法:用两步灌注法分离原代大鼠肝细胞;观察苯巴比妥钠(PNB)对环磷酰胺(CP)致离体大鼠肝细胞的毒性作用。采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定... 详细信息

目的:利用原代培养正常大鼠肝细胞研究苯巴比妥钠(PNB)对环磷酰胺(CP)致离体大鼠肝细胞的毒性作用。方法:用两步灌注法分离原代大鼠肝细胞;观察苯巴比妥钠(PNB)对环磷酰胺(CP)致离体大鼠肝细胞的毒性作用。采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定PNB对原代大鼠肝细胞的最大无毒浓度(TC0),先用PNB的最大无毒浓度(TC0)诱导原代大鼠肝细胞24h,再直接加含不同浓度CP的培养液培养24h,MTT法测药物对细胞生长抑制率的影响,计算IC50。并测定药物作用后培养液上清中AST、ALT和LDH活性及培养液中GSH和细胞内GSH的含量。结果:经苯巴比妥钠诱导后的环磷酰胺各剂量组与未经苯巴比妥钠诱导的环磷酰胺各剂量组比较,细胞生长抑制率降低,培养液上清AST、ALT和LDH活性降低,培养液上清和细胞内GSH含量升高。结论:苯巴比妥钠能减轻环磷酰胺致离体大鼠肝细胞的毒性作用。

关键词：苯巴比妥钠环磷酰胺原代大鼠肝细胞细胞毒性

mPEG-PLGA聚合物对大鼠肝脏CYP450酶活性的影响

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中国医院药学杂志 2016年第15期36卷 1276-1282页

作者：邱丽慧斯陆勤涂坤吴琪李高黄建耿孙明辉华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部湖北武汉430030 华中科技大学同济医学院药学院湖北武汉430030

目的：研究mPEG-PLGA聚合物对大鼠肝CYP450酶活性的影响。方法：采用芘荧光探针技术测定mPEG-PLGA聚合物的临界胶束浓度（CMC）,并用薄膜分散法制备mPEG-PLGA聚合物胶束;分别采用大鼠肝微粒体和原代大鼠肝细胞模型,将mPEG-PLGA聚合物溶... 详细信息

目的：研究mPEG-PLGA聚合物对大鼠肝CYP450酶活性的影响。方法：采用芘荧光探针技术测定mPEG-PLGA聚合物的临界胶束浓度（CMC）,并用薄膜分散法制备mPEG-PLGA聚合物胶束;分别采用大鼠肝微粒体和原代大鼠肝细胞模型,将mPEG-PLGA聚合物溶液与CYP450酶特异性探针底物孵育,经液-质联用技术（LC-MS/MS）检测代谢产物,通过比较代谢产物生成量的变化,评价聚合物对CYP450酶的抑制和诱导作用。结果：mPEG-PLGA聚合物的CMC为5.37μg·mL^-1;mPEG-PLGA聚合物浓度低于CMC时对大鼠肝CYP450酶无抑制作用;当聚合物胶束质量浓度≥100μg·mL-1时显示有抑制作用,且呈现浓度依赖性。mPEG-PLGA聚合物对CYP1A1/B2、CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP2C11、CYP2D2、CYP3A1/2（底物为咪达唑仑）、CYP3A1/2（底物为睾酮）7种酶亚型的IC50值分别为1.13,2.37,2.38,1.77,1.32,1.17,1.12,0.91 mg·mL^-1,其中对CYP3A1/2的抑制作用最为明显。mPEG-PLGA聚合物在0.1～1 000μg·mL-1质量浓度范围对CYP1A2酶均有诱导作用,且在高质量浓度1 000μg·mL-1时最强（P〈0.001）;而该聚合物仅在0.1μg·mL-1时对CYP2B1、CYP2C6和CYP3A1/2酶呈现诱导作用（P〈0.05）。结论：mPEG-PLGA聚合物对大鼠肝脏CYP450酶亚型活性有一定的抑制和诱导作用,其抑制和诱导作用程度与酶亚型种类和聚合物浓度有关。

关键词： mPEG-PLGA聚合物 CYP450 大鼠肝微粒体原代大鼠肝细胞抑制诱导

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重庆市饮用水中有机污染物的遗传毒性研究

重庆市饮用水中有机污染物的遗传毒性研究

作者：邱志群第三军医大学

学位级别：硕士

水中的有机污染物主要来源于由各种途径汇集到水体的各种人工合成的有机物质。其中许多已经被证实即使在极其微量的情况下也可对机体产生诸如致突变、致癌、破坏生殖、干扰内分泌等危害。同时部分水中有机污染物具有高生物富集性与环境... 详细信息

水中的有机污染物主要来源于由各种途径汇集到水体的各种人工合成的有机物质。其中许多已经被证实即使在极其微量的情况下也可对机体产生诸如致突变、致癌、破坏生殖、干扰内分泌等危害。同时部分水中有机污染物具有高生物富集性与环境高滞留性，可对人类健康产生严重的负面影响。全世界由地面水中检测出的有机污染物有2221种，其中不少为致癌、促癌和致突变物。由于水中有机污染物常以混合的方式联合作用于人体，其遗传毒性与致癌性之间存在一定的相关性，所以，常通过检测水中混合有机物的遗传毒性来评价其对人体健康的影响。重庆市主城区拥有六百万人口，长江及嘉陵江为其主要饮用水源，工业生产带来的水环境污染问题较为严重。流行病学研究表明重庆城区的肝癌死亡率明显高于全国城市水平。孙安龙等对重庆市原发性肝癌的危险因素进行研究后发现，乙肝感染、饮水类型以及肝胆器官疾病史是相关程度最大的危险因素，可见饮用水污染是危害重庆居民健康的重要因素。而且随着三峡工程的竣工重庆市将处于三峡库区，三峡大坝蓄水后水流的减缓必将加重污染，对重庆市饮用水与人群健康关系的研究更显迫切。本研究用固相萃取法提取重庆市主城区5个水厂三个不同水期(春季-平水期、夏季-丰水期、冬季-枯水期)的水源水与出厂水中有机污染物；采用单细胞凝胶电泳实验检测了所有水样中有机污染物对原代大鼠肝细胞DNA的损伤情况；用Ames实验、微核实验检测了丰水期水样中有机污染物引起的基因突变与染色体畸变；并分别用单细胞凝胶电泳实验、微核实验观察了绿茶浸出液对水中有机提取物致原代大鼠肝细胞DNA损伤和小鼠骨髓红细胞染色体畸变的拮抗作用，同时测定了细胞培养液与小鼠肝脏中丙二醛的含量，初步探讨其拮抗机制。实验结果如下：一、重庆市主城区5个水厂的水源水与出厂水中有机物在一定的剂量范围内均可诱导原代大鼠肝细胞DNA损伤，并呈剂量反应关系，反映出重庆市的水源水与出厂水均受到不同程度的有机物污染。从分布看，以嘉陵江为水源的沙坪坝水厂、渝中区水厂的污染重于以长江为水源的和尚山水厂、江南水厂、西南制药厂水厂，即嘉陵江污染重于长江。从种类看，出厂水对原代大鼠肝细胞DNA损伤大于水源水(沙坪坝水厂除外)；从季节看，受污染的程度大致为冬季>春季>夏季。二、Ames实验结果显示丰水期嘉陵江水源水致突变物污染严重，以移码型致突变污染为特征；长江水源水的致突变污染较轻；嘉陵江和长江水源水经氯化消毒处理后，其致突变活性明显增强。出厂水致突变活性与水源水有关。三、丰水期的水源水与出厂水均能诱导小鼠PCEs微核率显著增加，其中以嘉陵江为水源的沙坪坝水厂与渝中区水厂的水样诱导的小鼠PCEs微核率高于以长江为水源的和尚山水厂、江南水厂、西南制药厂水厂。污染最严重的沙坪坝水厂水源水诱导的小鼠PCEs微核率达到30.25±4.50个/1000PCEs，为对照的15倍。以上结果表明重庆市丰水期的水源水与出厂水已经受到致染色体损伤有机物较为严重的污染，嘉陵江污染重于长江。四、绿茶浸出液具有拮抗水中有机提取物致致染色体畸变和大鼠肝细胞DNA损伤功能，且在一定的浓度范围内呈剂量反应关系。绿茶浸出液在很低的浓度(0.5μg/ml)即可显著的缩短细胞DNA的迁移长度，而且培养液中的MDA含量也显著降低，这提示其拮抗DNA损伤的机制之一是通过拮抗水中有机提取物对细胞的氧化损伤而实现的。

关键词： :有机污染物水源水出厂水 DNA损伤致突变染色体畸变原代大鼠肝细胞 Ames实验微核实验绿茶浸出液