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Phanerochaete chrysosporium厚垣孢子的产生条件及其分化机制研究

Phanerochaete chrysosporium厚垣孢子的产生条件及其分化机制研究

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作者：闫越河南师范大学

学位级别：硕士

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一株典型的白腐真菌,该菌株不仅具有非特异性的降解能力,而且能够产生具有抗逆性的厚垣孢子。真菌一旦形成了厚垣孢子,就可以有较长的货架期。本文描述了一种***厚垣孢子工业化生产的发... 详细信息

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一株典型的白腐真菌,该菌株不仅具有非特异性的降解能力,而且能够产生具有抗逆性的厚垣孢子。真菌一旦形成了厚垣孢子,就可以有较长的货架期。本文描述了一种***厚垣孢子工业化生产的发酵工艺。同时,探究其形成机制,以期指导生产。本课题研究具体分为以下内容:(1)介绍采用发酵工艺中补料分批培养形式,通过对厚垣孢子诱导培养基(补料)营养成分和发酵条件的单因素实验,得到了适用于工业发酵***产厚垣孢子的生产工艺。优化后的补料配方是诱导剂-a 3.8 g/L,七水合硫酸镁2.5 g/L,硫酸氨含量为3.0 g/L,葡萄糖含量为30.0 g/L、苯甲醇0.50 m L/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、氯化钙0.50g/L、吐温80 0.50 mL/L、维生素B1 0.001 g/L、微量元素液70.0 m L/L。最佳培养条件是:将100 m L、pH 4.5的四倍浓缩补料接入已培养48 h菌丝的培养基中,在35℃、160 r/min条件下振荡培养3 d,菌丝球干重及孢子数量分别是3.97 g/L、2.687×109个/L。(2)将上述优化的条件,应用于50 L发酵罐,最优的生产条件是将菌丝培养36 h后补料,补料后60 h放罐,收获厚垣孢子。与摇瓶相比,整个发酵周期缩短了24 h,厚垣孢子数量为5.710×109个/L,最终得到300.0 g产品,还原糖仅剩0.18 g/L。利用湿室载片培养技术测产品的萌发率为72%。(3)通过对固体培养基及接种时菌的状态的筛选比较,采用等比例秸秆麦麸培养基,接种1.0 g菌丝球发酵一周可产生大量厚壁的大孢子细胞,形成的菌垫约厚2.5 mm,与空气接触面较光滑且形成少量分生孢子,余1.336 g秸秆麸皮,利用率达86.64%。该大孢子细胞的特征是细胞壁普遍较液体发酵的厚垣孢子厚,且直径较大,测得的最大直径约70μm,在直径为40μm的大孢子中,细胞壁厚约6.7μm。(4)应用荧光染色技术测厚垣孢子成分。细胞壁由薄外壁及厚内壁组成,增厚部分由含β-1,4-糖苷键的多糖组成。细胞内含大量的中性脂肪酸。在纤维素酶解实验中,20 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.244 g/L和0.215g/L,即纤维素不是厚垣孢子增厚细胞壁的主要成分;在β-葡聚糖酶解实验中,20 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.480 g/L和0.598 g/L,即厚垣孢子葡聚糖含量较高;在几丁质酶解实验中,5 mg等量的菌丝和厚垣孢子细胞壁经酶解,测得的终产物浓度分别为0.313 g/L和0.290 g/L,即两者含量无明显差异。(5)锁定三条主要的显著富集的代谢通路—淀粉和蔗糖代谢通路、MAPK代谢通路及脂肪酸降解通路,并推导出***的葡聚糖合成路径、脂肪酸代谢路径及MAPK调控路径,推测厚垣孢子增厚的细胞壁成分可能与葡聚糖有关,细胞内合成同时积累脂肪酸,为维持正常生长提供能量。选取六个相关的基因进行qRT-PCR验证,从整体上看此次转录组测序结果比较可信。

关键词：黄孢原毛平革菌厚垣孢子液体发酵厚垣孢子成分差异表达基因实时荧光定量PCR

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