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卵黄高磷蛋白磷酸肽在Caco-2细胞单层模型中的促钙转运作用

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中国食品学报 2023年第6期23卷 8-17页

作者：李松明赵梦蝶刘伟马美湖金永国黄茜华中农业大学食品科学技术学院、蛋品加工技术国家地方联合工程中心农业农村部蛋品加工重点实验室武汉430070 宜宾林竹产业研究院四川宜宾644000

结合高温低压处理、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶复合酶解制备具有高钙结合能力的卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin phosphopeptides,PPP)。通过优化确定制备PPP-Ca的最佳条件为pH 9.5,多肽与钙质量比7∶1,此条件下钙螯合率达到97%,PPP-Ca在模... 详细信息

结合高温低压处理、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶复合酶解制备具有高钙结合能力的卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin phosphopeptides,PPP)。通过优化确定制备PPP-Ca的最佳条件为pH 9.5,多肽与钙质量比7∶1,此条件下钙螯合率达到97%,PPP-Ca在模拟胃肠道消化中显示了极高的稳定性。使用Caco-2细胞单层模型验证PPP-Ca在体外的钙转运作用,通过细胞形态、电阻值和荧光素钠透过率等验证Caco-2细胞模型,毒性实验(MTT)结果显示PPP-Ca对Caco-2细胞呈现低毒性作用。研究PPP-Ca和PPP对Caco-2细胞转运钙离子质量浓度和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性的影响,采用RT-PCR测定Calbindin D9K mRNA的相对表达量。结果表明,PPP和PPP-Ca能够显著提高AKP活性,钙转运量从(3.06±0.08)μg增到(5.66±0.62)μg,Calbindin D9K mRNA的表达量增加2倍,进而增强人体肠道中钙的转运吸收。研究结果为开发新的钙补充剂和卵黄高磷蛋白提供了科学证据。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽肽钙螯合物稳定性 Caco-2细胞转运吸收

卵黄高磷蛋白磷酸肽及其钙螯合物在双细胞共培养体系中对成骨细胞分化的促进作用

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现代食品科技 2022年第12期38卷 154-160页

作者：周聪聪赵梦蝶李松明马美湖金永国黄茜华中农业大学食品科学技术学院蛋品加工技术国家地方联合工程中心湖北武汉430070

研究了卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin Phosphopeptide,PPP)及其钙螯合物(PPP-Ca)在成骨细胞(MC3T3-E1)和破骨前体细胞(RAW264.7)共培养体系中对成骨细胞分化的调节作用。对细胞毒性、碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性和... 详细信息

研究了卵黄高磷蛋白磷酸肽(Phosvitin Phosphopeptide,PPP)及其钙螯合物(PPP-Ca)在成骨细胞(MC3T3-E1)和破骨前体细胞(RAW264.7)共培养体系中对成骨细胞分化的调节作用。对细胞毒性、碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性和TRAP染色进行分析;用RT-PCR技术进一步探究成骨细胞RANKL/OPG通路相关蛋白的mRNA表达情况。结果发现,PPP和PPP-Ca可以使MC3T3-E1体系中的AKP活性分别增加9.5%和12.7%;PPP和PPP-Ca的加入可以使MC3T3-E1体系中OPG基因mRNA的表达量从0.92分别提升至1.25和1.39、使RANKL基因mRNA的表达量从1.00分别提升至1.23和1.45。该研究结果表明,PPP和PPP-Ca可有效促进成骨细胞的分化。实验结果为进一步探索磷酸肽在多细胞模型体系中的作用提供了研究基础,同时为磷酸肽的功能活性开发提供理论依据。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽肽钙螯合物共培养成骨细胞

卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙对受试小鼠钙表观吸收率的影响

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食品科学 2008年第12期29卷 654-657页

作者：王飞刘静波林松毅徐彩娜蔡玥吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室吉林长春130062

本实验借助营养成分常规检测方法和原子吸收检测法对三种卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙样品进行样品纯度检测和含钙量的分析。对样品采用羧甲基纤维素进行预处理后,选用葡萄糖酸钙市场上常见的补钙制剂与之比较,通过小鼠动物实验来研究这种补... 详细信息

本实验借助营养成分常规检测方法和原子吸收检测法对三种卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙样品进行样品纯度检测和含钙量的分析。对样品采用羧甲基纤维素进行预处理后,选用葡萄糖酸钙市场上常见的补钙制剂与之比较,通过小鼠动物实验来研究这种补钙制剂对处于生长期的小鼠钙吸收率的影响。结果表明,在三种卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙样品中,PPP3纯度最高且含钙量最高;在小鼠的体重增长过程中三种样品均没有显著差异,说明卵黄高磷蛋白磷酸肽-钙对小鼠的体重没有影响;在钙的表观吸收率方面,其中PPP3-钙高剂量组的钙的表观吸收率最高,这组数据表现为对空白组和对照组均有显著差异(p<0.05),往下依次为PPP3-钙中剂量组、PPP2-钙中剂量组、PPP1-钙中剂量组和PPP3-钙补剂低剂量组,均表现为与空白组差异显著(p<0.05)。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽小鼠表观吸收率

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卵黄高磷蛋白磷酸肽的理化性质研究

食品工业科技 2009年第12期30卷 176-179页

作者：刘静波徐彩娜王二雷殷涌光吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室吉林长春130062 吉林大学生物与农业工程学院吉林长春130025

卵黄高磷蛋白磷酸肽的主要生物学功能是促进钙吸收,本文主要探讨了卵黄高磷蛋白磷酸肽的溶解性和稳定性,考察了pH、氯化钠浓度、EDTA浓度、柠檬酸浓度对卵黄高磷蛋白磷酸肽溶解度的影响,以及卵黄高磷蛋白磷酸肽的热稳定性、与CaCl2的稳... 详细信息

卵黄高磷蛋白磷酸肽的主要生物学功能是促进钙吸收,本文主要探讨了卵黄高磷蛋白磷酸肽的溶解性和稳定性,考察了pH、氯化钠浓度、EDTA浓度、柠檬酸浓度对卵黄高磷蛋白磷酸肽溶解度的影响,以及卵黄高磷蛋白磷酸肽的热稳定性、与CaCl2的稳定性、乳化稳定性。结果表明,在1·2%的EDTA溶液中,当pH为6时,卵黄高磷蛋白磷酸肽的溶解度最好,高达90%以上,卵黄高磷蛋白磷酸肽的热稳定性良好;Ca2+的存在对卵黄高磷蛋白磷酸肽的影响不大;卵黄高磷蛋白磷酸肽的乳化性较粗蛋白的乳化性下降了1·72倍。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽溶解性稳定性理化性质

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卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备技术研究

食品工业 2016年第3期37卷 54-58页

作者：刘瑜王二雷徐彩娜刘静波农业部规划设计研究院北京100125 吉林大学军需科技学院长春130062 中国科学院长春应用化学研究所长春130022

为优化卵黄高磷蛋白磷酸肽的水解工艺,首先进行脱磷酸化处理后,在单因素的基础上采用响应面法优化水解工艺,选取水解温度、水解p H和水解时间三个因素进行试验,并在最佳工艺下对制得的卵黄高磷蛋白磷酸肽进行了氨基酸组分分析和阻止磷... 详细信息

为优化卵黄高磷蛋白磷酸肽的水解工艺,首先进行脱磷酸化处理后,在单因素的基础上采用响应面法优化水解工艺,选取水解温度、水解p H和水解时间三个因素进行试验,并在最佳工艺下对制得的卵黄高磷蛋白磷酸肽进行了氨基酸组分分析和阻止磷酸钙沉淀效果分析。结果表明,底物浓度为1%,碱浓度为0.1 mol/L,在此条件下脱磷20 min,脱磷效果最佳;最优的水解温度为50.0℃,水解时间为160 min,水解p H为8.5,在此条件下水解度为16.64%;卵黄高磷蛋白磷酸肽中氨基酸含量比粗蛋白中氨基酸提高近两倍,且丝氨酸含量占磷酸肽样品中所有氨基酸的31.35%;随着水解度的增加,卵黄高磷蛋白磷酸肽的浓度越高,其阻止磷酸肽沉淀效果越好,且存在一定的剂量依赖关系。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽响应面法氨基酸分析阻止磷酸钙沉淀

钙结合卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备及其肽钙螯合物的结构表征

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食品科学 2023年第6期44卷 125-133页

作者：宋丽朱临娴宋璐杉司凯巩婷婷刘会平张晓维天津科技大学食品科学与工程学院食品营养与安全国家重点实验室天津市食品质量与健康重点实验室天津300457

以鸡蛋蛋黄为原料制备卵黄高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptide,PPP),并与钙离子螯合制备肽钙补充剂。通过高温高压处理卵黄高磷蛋白,先用胰蛋白酶酶解,以水解度和肽钙结合率为指标,进一步优化碱性蛋白酶的酶解条件以制备PPP。PPP... 详细信息

以鸡蛋蛋黄为原料制备卵黄高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptide,PPP),并与钙离子螯合制备肽钙补充剂。通过高温高压处理卵黄高磷蛋白,先用胰蛋白酶酶解,以水解度和肽钙结合率为指标,进一步优化碱性蛋白酶的酶解条件以制备PPP。PPP与钙螯合获得螯合物PPP-Ca,通过紫外光谱、红外光谱分析、圆二色谱分析、扫描电镜和Zeta电位分析表征PPP-Ca的结构特性。结果表明最佳酶解条件为加酶量5%、酶解90 min、pH 9.0、温度40℃,在此最优条件下水解度为(25.45±0.17)%,肽钙结合率为(93.41±1.10)%。结构表征发现PPP-Ca主要通过羧基、氨基和磷酸基团相互作用结合,PPP和钙离子结合后其结构变得紧密有序,且有聚集现象。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽肽钙螯合物复合酶酶解结构表征

卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备技术及其功能特性的研究

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卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备技术及其功能特性的研究

作者：刘瑜吉林大学

学位级别：硕士

本研究是吉林大学农学部刘静波教授主持的博士基金课题《卵黄高磷蛋白的提取及其水解制备磷酸肽的研究》内容之一。卵黄高磷蛋白磷酸肽含有成簇的磷酸酞丝氨酸残基,可与钙离子形成可溶性络合物,阻止其形成沉淀,促进钙吸收的能力,具有极... 详细信息

本研究是吉林大学农学部刘静波教授主持的博士基金课题《卵黄高磷蛋白的提取及其水解制备磷酸肽的研究》内容之一。卵黄高磷蛋白磷酸肽含有成簇的磷酸酞丝氨酸残基,可与钙离子形成可溶性络合物,阻止其形成沉淀,促进钙吸收的能力,具有极其重要的研发价值。本论文首先通过非水溶性蛋白干重和脂肪残留率等指标优化出有机溶剂法提取卵黄高磷蛋白的最佳工艺参数,并利用N/P(摩尔比)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的相对分子质量等指标分析出最佳提取技术所获得的卵黄高磷蛋白产品的纯度;其次,在对比分析胰蛋白酶、Alcalse酶等蛋白酶对卵黄高磷蛋白水解效果和蛋白质脱磷酸化对酶解效果影响等研究的基础上,重点研究以水解度为衡量指标,采用正交试验和多元线性回归正交试验等方法,优化酶法制备卵黄高磷蛋白磷酸肽的工艺路线及其最佳技术参数;在利用乙醇钙沉淀法纯化卵黄高磷蛋白磷酸肽的技术研究中,以N/P(摩尔比)为衡量指标,二次回归正交组合设计为手段,优化出卵黄高磷蛋白磷酸肽纯化的最佳技术参数;通过测定灰分含量、水分含量、总钙含量、N/P(摩尔比)以及卵黄高磷蛋白磷酸肽含量等指标,衡量出不同处理条件下的卵黄高磷蛋白磷酸肽产品纯度;对所制得的卵黄高磷蛋白磷酸肽功能性质进行的体外研究试验中发现卵黄高磷蛋白磷酸肽具有阻止磷酸钙和亚铁离子形成沉淀的作用,温度对卵黄高磷蛋白磷酸肽的功能性质没有影响,同时食品中柠檬酸的存在对卵黄高磷蛋白磷酸肽有一定的协同作用。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽酶解 Ca2+ 功能特性

卵黄高磷蛋白磷酸肽制备及体外抗炎作用的研究

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卵黄高磷蛋白磷酸肽制备及体外抗炎作用的研究

作者：王亮天津商业大学

学位级别：硕士

卵黄高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptide,PPPs)具有抗菌、抗氧化和促钙吸收等功能,并具有潜在的抗炎作用。本研究探讨了以鸡为原料制备卵黄高磷蛋白及其磷酸肽的工艺条件,并在细胞水平上研究分析了PPPs的体外抗炎作用。首先,确定... 详细信息

卵黄高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptide,PPPs)具有抗菌、抗氧化和促钙吸收等功能,并具有潜在的抗炎作用。本研究探讨了以鸡为原料制备卵黄高磷蛋白及其磷酸肽的工艺条件,并在细胞水平上研究分析了PPPs的体外抗炎作用。首先,确定了蛋黄卵黄高磷蛋白(PVs)粗制品经阴离子交换树脂QSFF纯化的最佳工艺条件:平衡缓冲液为NaAc/HAc缓冲液(20 mmol/L、pH 5.0),以含0.3、0.5、0.6 mol/L NaCl的NaAc/HAc缓冲液分步洗脱;所得蛋白的N/P摩尔比为2.78,回收率57.6%,蛋白质含量85.66%,纯度95.43%,且PVs含有β-PVs、α1-PVs和α2-PVs三种组分,分子量分别为44.4 Ku、37.5 Ku和42.0 Ku,相对含量分别为67.95%、4.17%和23.30%。然后,以酶解水解度(DH)以及酶解产物抑制RAW264.7细胞产生NO量的抑制率(IA)为效应值,通过单因素试验以及响应面法确定酶解PVs制备PPPs的工艺条件。其中:单因素试验确定了底物浓度2%,酶解时间3 h,选定了NaOH预处理浓度、pH和温度作为响应面法进一步优化的因素,同时也证明了在适当作用时间内控制碱预处理PVs时NaOH浓度可以控制PVs脱磷率,而不同脱磷率的PVs的酶解产物抑制RAW264.7细胞产生NO量的抑制率具有不同的性能;响应面法中通过中心复合旋转回归模型优化了NaOH预处理浓度、pH值以及酶解温度这三个因素的值分别为0.26 mol/L、8.12、40.39℃;此条件下酶解产物PPPs对LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生的抑制率(IA)为61.25%;终产物PPPs灰分含量2.03%,水分含量1.50%,N/P为11.97。最后,在细胞水平上研究了PPPs抗炎作用,采用LPS刺激Caco-2和RAW264.7细胞建立炎症模型,测定PPPs对TNF-α、IL-6、IL-8的分泌量和NO合成量的影响。PPPs可显著抑制NO的合成且具有剂量依赖作用,且对RAW264.7细胞的抑制作用高于Caco-2,如:PPPs浓度为1000μg/ml时,对RAW264.7细胞产生NO的抑制率为70%,而对Caco-2细胞抑制率仅为47%;PPPs可抑制LPS诱导的TNF-α的分泌,PPPs浓度为1000μg/ml时抑制效果最好,呈现剂量依赖性;PPPs可显著抑制RAW264.7细胞IL-6的分泌,在0.1-100μg/ml的浓度范围内对IL-6分泌的抑制作用呈现剂量依赖性;PPPs浓度高于10μg/ml时可显著抑制Caco-2细胞IL-8的分泌,且在10-1000μg/ml的浓度范围内,PPPs抑制Caco-2细胞分泌IL-8的作用呈剂量依赖性。结果表明PPPs通过下调Caco-2和RAW264.7炎症因子的表达水平发挥体外抗炎作用。

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽阴离子交换层析细胞因子抗炎活性

卵黄高磷蛋白磷酸肽钙复合物的制备及其促钙吸收机制研究

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卵黄高磷蛋白磷酸肽钙复合物的制备及其促钙吸收机制研究

作者：赵梦蝶华中农业大学

学位级别：硕士

卵黄高磷蛋白(Phosvitin,PV)是鸡蛋蛋黄中的一种磷酸化糖蛋白,该蛋白质中含有的磷酸化氨基酸,赋予了PV较好的乳化性、抗氧化能力及螯合金属离子能力等特性。本课题以PV作为研究对象,制备卵黄高磷蛋白磷酸肽钙复合物(PPP-Ca),探究PPP与C... 详细信息

卵黄高磷蛋白(Phosvitin,PV)是鸡蛋蛋黄中的一种磷酸化糖蛋白,该蛋白质中含有的磷酸化氨基酸,赋予了PV较好的乳化性、抗氧化能力及螯合金属离子能力等特性。本课题以PV作为研究对象,制备卵黄高磷蛋白磷酸肽钙复合物(PPP-Ca),探究PPP与Ca的结合特性及PPP-Ca在体内调控肠道Ca吸收转运的作用机制。进而在此基础上,建立成骨细胞(MC3T3-E1细胞)和破骨前体细胞(RAW264.7细胞)直接接触共培育体系,从骨矿化环节展开进一步研究。主要研究内容和实验结果如下:(1)通过高温中压(HTMP)预处理方法制备预处理卵黄高磷蛋白(HTMP-PV),再结合胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶复合酶解制备PPP,以钙螯合率为指标筛选制备PPP-Ca的最优条件。确定HTMP预处理条件为:PV浓度10 mg/m L,p H 6.5,于120℃、0.1 MPa下处理30 min,其SDS-PAGE图显示HTMP-PV的分子量大小明显降低。以水解度和钙结合率为指标筛选得出:嗜热菌蛋白酶的最优酶解条件为HTMP-PV浓度10 mg/m L、加酶量2000 U/g、p H 6.8、酶解温度68℃,酶解时间24h。通过在胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶最适条件下依次酶解,PV酶解物钙结合率为43.01%,水解度为45.55%。在制备PPP-Ca的单因素条件筛选中,PPP和Ca的反应温度和反应时间对肽钙螯合过程没有显著影响,肽钙质量比为7:1,p H 9.5,其钙结合率最高,能达到97%以上。(2)通过傅里叶变换红外光谱、Zeta电位、XRD等方法分析PPP与钙结合前后的结构变化。结果表明:红外光谱表征发现钙主要结合在PPP的磷酸基团上,另外氨基和羧基上也提供了一些钙的结合位点;Zeta电位显示,PV经过HTMP+复合酶解后PPP的Zeta值从-42.47 m V下降到-57.13 m V,表明负电荷增加,而PPP与Ca结合后其Zeta值上升到-24.2 m V,电负性降低;XRD表征验证PPP会与Ca形成复合物,导致Ca的特征峰被掩盖。进一步测定PPP-Ca的酸碱稳定性、热稳定性和模拟消化稳定性。发现PPP-Ca在中性和碱性环境下较为稳定,但对酸性环境非常敏感性,并具有良好的热稳定性和体外模拟消化稳定性。(3)建立低钙小鼠模型,探究PPP-Ca在体内对肠道钙吸收转运的作用机制。结果表明:PPP-Ca能有效的缓解因低钙饮食引起的血清AKP异常升高(18.93 Gold units/100 m L),使之降低到11.09 Gold units/100 m L,达到正常钙摄入组水平(10.89Gold units/100 m L)。股骨钙含量指标发现PPP-Ca组的股骨钙含量达到94.33 mg/g,与低钙对照组的80.47 mg/g相比有明显提高,表明PPP-Ca能有效的改善因钙缺乏引起的骨钙流失。并通过Western Blotting(WB)技术检测小鼠十二指肠TRPV6钙离子通道相关蛋白表达量,发现PPP-Ca能够影响TRPV6通道相关蛋白的表达,下调由于缺钙引起的Calbindin D9K蛋白的过量表达。(4)构建Caco-2细胞单层膜模型,通过检测钙跨膜转运量和TRPV6钙离子通路相关蛋白m RNA的相对表达量,探究卵黄高磷蛋白磷酸肽及肽钙复合物体外促钙吸收机制。结果显示:在建模21 d后,Caco-2细胞单层膜极化现象明显,TEER值达到860Ω·cm以上,且荧光黄通透性为7.79×10cm/s,可以用于转运实验。在测定钙转运量和TRPV6钙离子通路相关蛋白m RNA的表达量指标中,结果发现:经过不同浓度的Ca Cl溶液处理后,Caco-2细胞钙转运量呈现一定的浓度依赖性;在用样品处理3 h后,发现PPP-Ca的钙转运量为5.66μg,显著高于Ca Cl组的钙转运量(3.07μg),表明PPP-Ca可以促进Caco-2细胞单层膜的Ca转运量,同时PPP-Ca能影响Caco-2细胞TRPV6钙离子通路相关蛋白Calbindin D9K m RNA的表达情况。(5)建立成骨细胞(MC3T3-E1细胞)和破骨前体细胞(RAW264.7细胞)共培养体系,探究PPP和PPP-Ca对成骨细胞和破骨细胞活性、分化的影响。结果表明:PPP和PPP-Ca能有效提高共培养体系中MC3T3-E1细胞的AKP活性,在MC3T3-E1细胞与RAW264.7细胞以1:1接种密度中,PPP组和PPP-Ca的AKP值分别为2.39金氏单位/100 m L和2.77金氏单位/100 m L,显著高于对照组的2.05金氏单位/100 m L。同时PPP和PPP-Ca可以降低共培养体系中RAW264.7细胞的TRAP活性,PPP组和PPP-Ca的TRAP值分别为2.69 U/L和2.46 U

关键词：卵黄高磷蛋白磷酸肽肽钙复合物 TRPV6钙离子通路 Caco-2细胞单层模型细胞共培养体