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大草蛉雄虫卵黄原蛋白基因的鉴定和表达特征

中国生物防治学报 2021年第1期37卷 77-85页

作者：冯彦姣刘小平张婷婷陈红印王孟卿刘晨曦李玉艳张礼生毛建军中国农业科学院植物保护研究所北京100193 东北农业大学哈尔滨150040

为探索卵黄原蛋白基因对大草蛉雄虫生殖生理等活动的调节作用,利用PCR技术克隆了大草蛉卵黄原蛋白基因部分cDNA序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在不同发育阶段和不同组织的表达特征。结果表... 详细信息

为探索卵黄原蛋白基因对大草蛉雄虫生殖生理等活动的调节作用,利用PCR技术克隆了大草蛉卵黄原蛋白基因部分cDNA序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在不同发育阶段和不同组织的表达特征。结果表明,克隆到的卵黄原蛋白基因的cDNA长度为1501 bp,编码501个氨基酸,其预测的蛋白质分子量为206 kD,等电点8.11,具有vitellogenin保守的半胱氨基酸残基、GL/ICG、RXXR等结构域。序列分析表明大草蛉vitellogenin与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不太高,在29.46%~36.43%,与骚扰锥蝽在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果显示vitellogenin在不同日龄的成虫中表达量没有显著差异;在雄虫的腹部表达量较高,均高于头部和胸部,且头部和胸部的表达量之间没有显著差异,表达量均较低。结果表明vitellogenin基因在大草蛉中的表达具有组织的特异性,推测其可能参与大草蛉雄虫生殖调控。

关键词：大草蛉卵黄原蛋白基因克隆表达

氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾不同抗性品系发育繁殖和卵黄原蛋白基因表达的影响

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氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾不同抗性品系发育繁殖和卵黄原蛋白基因表...

作者：姚新鸽四川农业大学

学位级别：硕士

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)是一种间歇性大发生的多食性害虫,其防治仍然以使用化学杀虫剂为主,而双酰胺类杀虫剂是近年来用于防治鳞翅目害虫的首选药剂。本文比较了甜菜夜蛾氯虫苯甲酰胺抗性品系和敏感品系生长发育和繁殖的差... 详细信息

甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)是一种间歇性大发生的多食性害虫,其防治仍然以使用化学杀虫剂为主,而双酰胺类杀虫剂是近年来用于防治鳞翅目害虫的首选药剂。本文比较了甜菜夜蛾氯虫苯甲酰胺抗性品系和敏感品系生长发育和繁殖的差异,并初步探讨了两者生殖力差异的分子机制,取得了如下结果:1.采用饲料混毒法进行生物测定,以甜菜夜蛾乐山种群(LS-F)为基础采用双向筛选法连续筛选6代,得到抗性品系(CH-RE)和敏感品系(CH-SE),其抗性倍数分别为226.69和3.72。2.通过解剖CH-RE和CH-SE品系雌成虫卵巢研究表明,与CH-SE品系比较,CH-RE品系的实际产卵量和产卵率均显著降低,而卵巢重量、卵巢管长度和生殖腺系数差异不显著。荧光定量分析发现,CH-RE和CH-SE品系的卵黄原蛋白基因均在蛹化后第5 d开始表达,表达量最高值均为羽化后36 h时,但CH-SE品系的值显著高于CH-RE品系。3.采用两性生命表分析方法,比较了CH-RE和CH-SE品系生活史特征和品系参数的差异。结果表明,与CH-SE品系相比较,CH-RE品系3龄幼虫发育历期、预蛹期和成虫产卵前期(APOP)显著延长,雌雄成虫寿命显著增加,而产卵量显著减少,内禀增长率(r)、周限增长率(λ)和净增殖率(R)均显著降低,平均世代周期(T)显著延长,适合度(Rf)为0.25。4.利用转录组测序分析,得到了CH-SE和CH-RE品系的差异基因,一共拼接出39957条unigenes,其中有11891条被注释,对所拼接出的unigenes进行GO功能分析和KEGG分析,发现差异表达unigenes显著富集于代谢途径。通过荧光定量PCR验证转录组数据中上调表达的8个与繁殖和抗性相关的基因,结果与转录组数据表达情况基本一致。

关键词：甜菜夜蛾氯虫苯甲酰胺卵黄原蛋白基因两性生命表转录组

犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的克隆、表达及组织分布研究

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犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的克隆、表达及组织分布研究

作者：朱宏宏西南大学

学位级别：硕士

弓首蛔虫病(Toxocariasis)主要是由犬弓首蛔虫(Toxocara canis,***)寄生于宿主小肠而引起的一类寄生虫病。该病具有世界性分布的特点,有数据显示,世界各地***的感染率为0.9%4.7%。其感染性虫卵不仅可以感染犬,还可以感染多种动物及人类... 详细信息

弓首蛔虫病(Toxocariasis)主要是由犬弓首蛔虫(Toxocara canis,***)寄生于宿主小肠而引起的一类寄生虫病。该病具有世界性分布的特点,有数据显示,世界各地***的感染率为0.9%4.7%。其感染性虫卵不仅可以感染犬,还可以感染多种动物及人类,能引起眼睛幼虫移行症(Ocular larva migrans,OLM)、神经幼虫移行症(Nerve larvae migration,NLM)、隐秘幼虫移行症(Cryptic larval migration,CLM)和内脏幼虫移行症(Visceral larva migrans,VLM),导致严重的病理综合征。因此,该病在兽医公共卫生学上具有十分重要的意义。卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)是脂质转运蛋白家族成员之一,通常是在卵生非哺乳动物的卵巢外组织中合成,经卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,Vg R)介导的胞吞作用进入卵巢,分解为卵黄蛋白(Yolk protein,YP)、卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)、卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv)等功能性物质。研究发现,Vg不仅为胚胎发育提供营养元素,还具有促进动物卵母细胞的生长和分化、粒子载体、生物标志物、抗氧化活性、免疫防御等多种生理功能。随着秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)卵黄原蛋白基因的发现,陆续展开了对有齿食道口线虫(Oesophagostomum dentatum)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、毛圆线虫(Trichostrongylus vitrinus)等寄生虫卵黄原蛋白的相关研究,而有关犬弓首蛔虫Vg的研究还未见报道。本论文在实验室已有的***转录组数据基础上,对犬弓首蛔虫卵黄原蛋白(***-vg,Tc-vg)基因进行了克隆、原核表达和组织定位等相关研究。主要试验结果如下:***-vg基因的生物信息学分析运用分子生物学技术对Tc-vg基因进行了分析,结果显示该基因为一个完整的编码区序列(Coding sequence,CDS),大小为5082 bp,可编码1694个氨基酸;理论分子质量为198 kDa,等电点为6.19。信号肽在线预测显示其N端含有一个信号肽,裂解位点在18-19 aa处。由在线软件分析显示该蛋白在一级结构上以亲水性为主;含有三个功能结构域:Vitellogenin、DUF1943(domain of unknown function)以及v WD(von Willebrand factor type D domain)。二级结构中含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。在线分析Tc Vg磷酸化位点显示该蛋白中存在三种主要的磷酸化氨基酸,即磷酸化苏氨酸(p Thr)、磷酸化酪氨酸(p Tyr)和磷酸化丝氨酸(p Ser)共44个,分别为7、19、18。亚细胞定位分析为分泌通路;功能预测显示参与脂质分子的转运过程。根据Blast比对发现Tc-vg与猪蛔虫(Ascaris suum)、美洲钩虫(Necator americanus)和小杆线虫(Caenorhabditis briggsae)的相似性高达100%;系统进化分析显示Tc-vg与***(ERG83573)的亲缘关系最近;与***(XP13298422)、线虫(Pristionchus pacificus,KKA71696)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale,KIH69020)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus,CDJ93502)、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus,KJH46366)等的亲缘关系次之。***-vwd与Tc-duf1943结构域的克隆运用PCR技术,克隆获得了Tc-vg基因的两个功能结构域(Tc-duf1943和Tc-vwd)。其中,Tc-vwd结构域长度为834 bp,ORF长度为816 bp,编码272 aa,预测蛋白分子量大小为31.15 kDa,等电点为5.12。犬弓首蛔虫v WD(***-v WD,TcvWD)蛋白主要参与发病机理的生物学过程。Tc-duf1943结构域长度为882 bp,ORF大小为864 bp,编码288 aa,预测成熟蛋白分子量为33.25 kDa,等电点为9.57。犬弓首蛔虫DUF1943(***-DUF1943,Tc DUF1943)蛋白主要具有脂质定位和有机物质运输的生物学过程。***-vwd/pET28a与Tc-duf1943/pET28a表达载体的构建及原核表达按照TaKaRa公司的质粒提取试剂盒的说明对Tc-vwd/

关键词：犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因克隆表达组织分布

滇南中蜂蜂王卵黄原蛋白基因实时荧光定量PCR的建立

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蜜蜂杂志 2014年第11期34卷 6-8页

作者：陈顺安宋文菲王艳辉罗卫庭云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所

采用实时荧光定量PCR技术,以蜜蜂β-act in基因为内参,利用特异引物对滇南中蜂蜂王的卵黄原蛋白基因进行了转录水平上的定量分析。结果表明:所建立的SYBR Gr een-II实时荧光定量PCR技术扩增效率E=99.9%,R 2=0.99,最低检出量为13个循环... 详细信息

采用实时荧光定量PCR技术,以蜜蜂β-act in基因为内参,利用特异引物对滇南中蜂蜂王的卵黄原蛋白基因进行了转录水平上的定量分析。结果表明:所建立的SYBR Gr een-II实时荧光定量PCR技术扩增效率E=99.9%,R 2=0.99,最低检出量为13个循环。检测灵敏度高,能准确定量滇南中蜂初生蜂王中的Vg基因。

关键词：滇南中蜂蜂王卵黄原蛋白基因实时荧光定量PCR 扩增曲线标准曲线基因表达

家蚕卵黄原蛋白(BmVg)基因启动子的克隆与活性鉴定

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蚕业科学 2014年第3期40卷 382-388页

作者：杨从文沈关望张海燕彭芷昕陈恩祥邢润苗刘红玲韩超珊林英家蚕基因组生物学国家重点实验室西南大学重庆400716

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在家蚕蛹期脂肪体高量表达,研究家蚕卵黄原蛋白基因(BmVg)的转录调控机制及启动子活性,将有助于利用家蚕蛹生物反应器高效表达外源蛋白。设计特异引物,以家蚕蛹基因组DNA为模板PCR扩增得到BmVg长约1.5 kb的... 详细信息

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在家蚕蛹期脂肪体高量表达,研究家蚕卵黄原蛋白基因(BmVg)的转录调控机制及启动子活性,将有助于利用家蚕蛹生物反应器高效表达外源蛋白。设计特异引物,以家蚕蛹基因组DNA为模板PCR扩增得到BmVg长约1.5 kb的启动子片段。构建由不同长度截短BmVg启动子片段驱动荧光素酶报告基因表达的细胞转染载体pGL3-Vg Promoter,分析转染家蚕胚胎培养细胞BmE-SWU1中的BmVg启动子片段活性,结果显示最低截短至BmVg基因翻译起始位点上游90 bp的启动子片段具有转录活性。进一步用截短法分析不同长度启动子的活性,当启动子-752^-952 bp、-42^-152 bp区域被截掉后,启动子的转录活性明显降低,暗示这2个区域内可能存在与启动子启动效率相关的重要调控元件。

关键词：卵黄原蛋白基因启动子克隆活性区域家蚕蛹

甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达

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中国农业科学 2017年第22期50卷 4316-4324页

作者：赵静孙洋谭永安肖留斌姜义平柏立新江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c... 详细信息

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde Ⅰ和Xba Ⅰ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1。将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌Arctic Express,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性。在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体。采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异。【结果】扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 k D。通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 k D,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合。其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显。不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L时,Vg重组蛋白表达量最高。继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多。新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1﹕512 000。Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 k D左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达。雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48 h表达量最高,随后降低。【结论】纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L);制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律。

关键词：甜菜夜蛾卵黄原蛋白基因原核表达抗体制备表达模式

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广聚萤叶甲Vg基因的鉴定及表达分析

植物保护 2024年第3期50卷 278-286页

作者：周永平黄玉锋张燕马超陈红松桂富荣周忠实云南农业大学植物保护学院昆明650201 中国农业科学院植物保护研究所北京100193 甘肃省陇南市礼县畜牧兽医站陇南742200 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所南宁530007

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)作为雌性多功能生殖蛋白,为卵黄发生提供所需的储备能源。为明确Vg基因在广聚萤叶甲Ophraella communa生殖过程中的潜在作用,本研究通过RT-PCR技术克隆得到广聚萤叶甲的3个Vg基因,其OcVg1,OcVg2和OcVg3开放... 详细信息

卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)作为雌性多功能生殖蛋白,为卵黄发生提供所需的储备能源。为明确Vg基因在广聚萤叶甲Ophraella communa生殖过程中的潜在作用,本研究通过RT-PCR技术克隆得到广聚萤叶甲的3个Vg基因,其OcVg1,OcVg2和OcVg3开放阅读框(ORF)分别为5310、5322 bp和5298 bp,对应编码1768、1772和1764个氨基酸。其OcVgs蛋白具有LLTP超家族的保守结构域:LPD_N、DUF1943和VWD结构域;多位于N-端的多聚丝氨酸区(polyserine domains),保守的GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR基序和C-端半胱氨酸残基等。构建系统进化树发现,OcVgs与鞘翅目昆虫聚为一支。时空表达分析发现,OcVgs基因在不同组织及发育阶段的表达动态相似,在脂肪体中特异性高表达(P<0.05);在成虫羽化后的性成熟阶段的表达量最高,幼虫期的表达水平可以忽略不计(P<0.05)。研究结果为深入理解广聚萤叶甲生殖作用的分子机制奠定基础。

关键词：广聚萤叶甲卵黄原蛋白基因克隆序列分析表达水平

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幼虫信息素酯类混合物对中华蜜蜂育王质量的影响

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昆虫学报 2018年第3期61卷 300-307页

作者：胡景华张丽珍廖春华江武军曾志将颜伟玉江西农业大学蜜蜂研究所南昌330045 江西省养蜂研究所南昌330052

【目的】基于免移虫育王技术,探究幼虫信息素酯类混合物在育王中对中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王质量的影响,为优质蜂王的培育奠定基础。【方法】利用中华蜜蜂免移虫育王生产器培育蜂王,在幼虫60-64 h时向王台内注入1μL不同酯类组成... 详细信息

【目的】基于免移虫育王技术,探究幼虫信息素酯类混合物在育王中对中华蜜蜂Apis cerana cerana蜂王质量的影响,为优质蜂王的培育奠定基础。【方法】利用中华蜜蜂免移虫育王生产器培育蜂王,在幼虫60-64 h时向王台内注入1μL不同酯类组成的混合物(酯类混和物的浓度梯度分别为0,0.1%,1.0%和10.0%),待蜂王出房后测定蜂王初生重、胸重、胸宽以及单侧卵巢管数量;并利用荧光定量PCR测定蜂王卵巢卵黄原蛋白基因Vitellogenin(Vg),昆虫储存蛋白基因hexamerin70b(hex70b)和hexamerin110(hex110)的表达量。【结果】免移虫育王过程中添加3种信息素酯类混合物3E(1.0%甲基亚油酸酯、16.0%甲基亚麻酸酯和35.0%甲基油酸酯),不同浓度处理时蜂王的初生重较对照(石蜡油)均显著增加,但蜂王胸宽和胸重均无显著变化;0.1%和1.0%浓度处理组蜂王单侧卵巢管数显著增加;不同浓度处理组Vg和hex70b的表达量均无显著变化,但1.0%和10.0%浓度处理组蜂王卵巢的hex110表达量显著升高。4种信息素酯类混合物4E(4.5%甲基棕榈酸酯、1.0%甲基亚油酸酯、16.0%甲基亚麻酸酯和35.0%甲基油酸酯)试验组只有10.0%浓度处理组蜂王的初生重和单侧卵巢管数较对照显著上升(P0.05);0.1%和1.0%浓度处理组Vg的表达量、10.0%浓度处理组hex70b的表达量以及1.0%和10.0%浓度处理组hex110的表达量均显著上升(P0.05),10.0%浓度处理时hex70b的表达量也显著降低(P<0.05)。【结论】中华蜜蜂育王过程中添加1.0%的3E和10.0%的4E幼虫信息素酯类可以在一定程度上提高蜂王质量。

关键词：中华蜜蜂幼虫信息素卵黄原蛋白基因昆虫储存蛋白基因育王质量

BmVg启动子的改造与家蚕蛹期脂肪体生物反应器的研发

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BmVg启动子的改造与家蚕蛹期脂肪体生物反应器的研发

作者：张宇靖西南大学

学位级别：硕士

家蚕是一种重要的经济昆虫。其经济效益可以分为主要价值-蚕丝与附加价值-蚕蛹等。每年因缫丝而产生大量的蚕蛹,而对蚕蛹的经济价值挖掘较少,因此提高家蚕的附加价值就变得尤为重要。其中利用蚕蛹开发生物反应器成为一种重要手段。家蚕... 详细信息

家蚕是一种重要的经济昆虫。其经济效益可以分为主要价值-蚕丝与附加价值-蚕蛹等。每年因缫丝而产生大量的蚕蛹,而对蚕蛹的经济价值挖掘较少,因此提高家蚕的附加价值就变得尤为重要。其中利用蚕蛹开发生物反应器成为一种重要手段。家蚕生物反应器是指将外源基因导入家蚕体内,利用家蚕作为宿主来表达外源蛋白。选择合适的启动子对于开发生物反应器来说至关重要。研究表明家蚕卵黄原蛋白(Bombyx mori Vitellogenin,Bm Vg)占雌蛹总蛋白的含量最高时可达到40%。Bm Vg从家蚕上蔟第2天开始表达,并在整个蛹期脂肪体中持续高表达,具有显著的组织、时期以及性别特异性,满足开发生物反应器的条件。本课题组研究发现,长为1.0K bp的Bm Vg启动子活性高于之前所报道的Bm Vg启动子,且更具备内源Bm Vg的特性,但利用长为1.0K bp的Bm Vg启动子驱动外源基因的表达量远低于内源Bm Vg的表达量,且雌雄表达量差异较大。也有文献报道,增加增强元件可以提高靶基因的表达。因此,本研究旨在通过探究影响家蚕卵黄原蛋白性别特异性表达的主要原因以及增强元件对Bm Vg启动子驱动靶基因表达的影响,为Bm Vg启动子的应用以及构建蛹期脂肪体生物反应器奠定基础。获得的主要研究结果如下:*** CRE对Bm Vg启动子活性的影响有文献报道家蚕雌雄双性基因(Double-sex,DSX)转录因子可以通过结合在Bm Vg启动子上的DSX顺式调控元件(CRE)上调控Bm Vg的表达。首先,本研究利用长为1.0K bp(1.0K)的Bm Vg启动子(Bm Vg P1.0K)克隆了突变DSX CRE的Bm Vg P1.0K启动子(Bm Vg P1.0K-DSXm),双荧光素酶活实验结果表明,突变DSX CRE后的Bm Vg P1.0K启动子活性显著降低;接着构建了Bm Vg P1.0K-DSXm驱动红色荧光蛋白(Ds Red)表达的转基因载体,通过显微注射蚕卵,转基因阳性个体筛选,获得了突变DSX CRE的转基因素材。RT-PCR以及q PCR结果显示,突变DSX CRE后,雄性家蚕上蔟期脂肪体中外源Ds Red以及内源Bm Vg的表达量无显著的变化,雌性家蚕上蔟期脂肪体中外源Ds Red以及内源Bm Vg的表达量均显著降低。以上结果表明,Bm Vg在雄性家蚕中低量表达不是因为雄特异的DSX结合在Bm Vg启动子上的DSX CRE抑制了Bm Vg的表达。随后利用长为1.0K bp的Bm Vg启动子克隆了三倍重复DSX CRE的Bm Vg P1.0K的启动子(Bm Vg P1.0K-3DSX),将其连接在双荧光素酶报告载体上,双荧光素酶活实验结果表明,三倍重复DSX CRE后的Bm Vg P1.0K启动子活性显著升高。接着也构建了Bm Vg P1.0K-3DSX驱动Ds Red表达的转基因载体,通过转基因注射和阳性个体筛选,获得了三倍重复DSX CRE的转基因素材。RT-PCR以及q PCR结果显示,三倍重复DSX CRE后,雌雄家蚕上蔟期脂肪体中外源Ds Red表达量极显著升高,内源Bm Vg的表达量显著降低。以上结果表明,三倍重复DSX CRE后,Bm Vg P1.0K启动子活性提高,驱动靶基因表达的能力增强。这就暗示了雄性拼接形式的DSX对Bm Vg表达也有上调作用,只是上调幅度没有雌性拼接形式的DSX高。2.增强元件对Bm Vg P1.0K驱动外源蛋白表达的影响根据文献报道,通过添加增强元件可以提高GAL4/UAS系统驱动外源蛋白表达的能力,受此启发,本研究制备了由Bm Vg P1.0K驱动的不含有翻译增强元件(GP)以及增加翻译增强元件(ISGP)的两个GAL4转基因素材。同时,为了提高启动效率,本研究根据文献报道增加了UAS系统中UAS元件的拷贝数,即制备了融合Ds Red的20×UAS元件的转基因素材。将获得的两个GAL4转基因素材与UAS转基因素材杂交,检测杂交品系脂肪体中外源Ds Red的表达。结果显示,在化蛹第2天的两个杂交品系的雌性脂肪体中均观察到了明显红色荧光。q PCR以及Western bloting结果也显示,含有增强元件的雌性杂交品系脂肪体中外源Ds Red表达量显著高于不含增强元件的杂交品系。而在两个杂交品系的雄性脂肪体中,不含增强元件的杂交品系脂肪体中没有观察到红色荧光,而含有增强元件的杂交品系脂肪体中观察到了明显的红色荧光,且荧光强度与不含增强元件的雌性杂交品系相近。q PCR以及Western bloting结果也证明,含有增强元件的杂交品系雄性脂肪体中外源Ds Red表达量显著高于不含增强元件的杂交品系。这表明增强元件对Bm Vg P1.0K驱动外源蛋白有明显的促进作用,暗示了通过添加增强元件可以显著改善Bm Vg

关键词：家蚕蛹期脂肪体卵黄原蛋白基因性别特异性表达增强元件生物反应器