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鸡卵清蛋白基因调控序列的克隆与载体构建

浙江农业学报 2016年第3期28卷 412-419页

作者：黄菁朱志伟陈晓宇于福先潘建治浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

卵清蛋白(ovalbumin)基因在鸡基因组中只有一对等位基因,却能每天合成分泌多达2 g的蛋白,占据卵白蛋白质的50%以上,是外源基因载体表达调控构件的首选。该研究从输卵管特异性启动子方面着手,通过对卵清蛋白基因启动子的筛选优化,找出启... 详细信息

卵清蛋白(ovalbumin)基因在鸡基因组中只有一对等位基因,却能每天合成分泌多达2 g的蛋白,占据卵白蛋白质的50%以上,是外源基因载体表达调控构件的首选。该研究从输卵管特异性启动子方面着手,通过对卵清蛋白基因启动子的筛选优化,找出启动子增强因子的位置以及组织特异性区域。将卵清蛋白基因上游-922^-2 073和-2 801^-3 100区域平均分成12个长度约为150 bp的序列,分别插入到-921^+38序列的上游,成功构建12个系列表达载体,为进一步筛选短缩版优化启动子提供材料;卵清蛋白基因第一内含子区域截断成300 bp左右的迷你内含子序列,成功构建8个迷你内含子系列载体,为筛选优化的迷你内含子提供必要的材料;成功分离鸡输卵管上皮细胞并优化电转染条件,通过荧光素酶活性检测初步筛选出具有最强活性重组质粒pGL4-UP-1412和内含子重组质粒pGL4-mini-intron-3,同时推断出若干包含增强子序列区域。

关键词：卵清蛋白基因调控序列载体荧光素酶活性

基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建

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动物学报 2005年第4期51卷 685-690页

作者：张传生杜立新中国农业科学院畜牧研究所

利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(I... 详细信息

利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(IRES)、人工合成的含有Cre重组酶识别位点变异体交换盒m2/loxp71EGFPloxp66,一起构建了含有Hsvtk负筛选标记的针对鸡卵清蛋白基因位点的敲入型共表达基因打靶载体pSSCm2/71EGFP66IRESOV7.8;以猪β干扰素基因(βInterferon,IFNβ)为目的基因构建了穿梭载体pMDm2/66MCSIFNMCSLoxp71,经过限制酶酶切及部分测序鉴定,所构建载体结构正确。进一步将它们共转化组成性表达Cre的细菌BM25.8。

关键词：基因打靶胚胎干细胞 OV Cre重组酶 RMCE 卵清蛋白基因转基因鸡基因构建打靶载体内部核糖体进入位点

鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

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中国兽医学报 2001年第1期21卷 21-24页

作者：宇丽赵君张艳玲刘斌张守峰王凤阳赵宝全扈荣良殷震解放军军需大学军事兽医研究所吉林长春130062 吉林省长春市卫生防疫站

将氯霉素乙酰转移酶 ( CAT)基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合 ,构建了 p CAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因 5′调控序列 )表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液 ,转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表... 详细信息

将氯霉素乙酰转移酶 ( CAT)基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合 ,构建了 p CAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因 5′调控序列 )表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液 ,转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明 ,在鸡原代输卵管上皮细胞 ,转染后 4 8h表达量最高 ,为 0 .67μg/L;而在鸡成纤维细胞 ,不论有无类固醇激素存在 ,均不表达。结果提示 ,在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。

关键词：鸡卵清蛋白基因调控序列表达载体构建

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鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

黑龙江畜牧兽医 2016年第1期 5-7+11+257页

作者：郭政张秋婷吴志昊王春生安铁洙朴善花东北林业大学生命科学学院

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管... 详细信息

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。

关键词：鸡卵清蛋白基因启动子输卵管上皮活性检测

产蛋鸡感染H9N2亚型禽流感病毒后输卵管中卵清蛋白基因表达的变化

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产蛋鸡感染H9N2亚型禽流感病毒后输卵管中卵清蛋白基因表达的变化

作者：李涛西北农林科技大学

学位级别：硕士

H9N2亚型禽流感病毒（AIV）是低致病性的流感病毒，广泛分布于世界各地，是威胁家禽养殖业的最主要疾病之一。家禽感染后可出现呼吸困难、腹泻、产蛋率下降，蛋品质明显降低，出现软壳蛋、沙壳蛋、蛋清稀薄等现象，给家禽养殖业造成巨... 详细信息

H9N2亚型禽流感病毒（AIV）是低致病性的流感病毒，广泛分布于世界各地，是威胁家禽养殖业的最主要疾病之一。家禽感染后可出现呼吸困难、腹泻、产蛋率下降，蛋品质明显降低，出现软壳蛋、沙壳蛋、蛋清稀薄等现象，给家禽养殖业造成巨大的经济损失。卵清蛋白/卵白蛋白（Ovalbumin/OVA）是鸡输卵管组织的表达产物，是鸡蛋蛋清中的主要蛋白，占蛋清蛋白总重量的65%。鸡OVA基因表达调节鸡蛋中OVA的含量，但有关鸡感染H9N2AIV后鸡输卵管中OVA基因表达规律还未见报道。本试验用H9N2亚型禽流感病毒感染30周龄非免疫健康产蛋鸡，利用凯氏定氮法测定蛋清中蛋白含量，用实时荧光定量PCR检测鸡输卵管膨大部OVA mRNA表达量，目的是研究H9N2AIV感染对鸡蛋品质的影响。 1．收集健康对照组产蛋鸡与感染H9N2AIV产蛋鸡每天所产鸡蛋，用凯氏定氮法测定鸡蛋蛋清中蛋白含量。结果发现，与对照组相比，产蛋鸡感染H9N2AIV后七天内，鸡蛋蛋清中蛋白含量有下降的趋势，由10.64%逐渐下降为7.21%。其中，对照组鸡蛋蛋清中蛋白含量为10.64%;产蛋鸡感染H9N2AIV后1天，鸡蛋蛋清中蛋白含量下降为10.43%;感染后2天，鸡蛋蛋清中蛋白含量下降为8.74%;感染后3、4、5、6、7天，鸡蛋蛋清中蛋白含量分别为7.68%、7.70%、7.65%、7.54%、7.21%。这表明H9N2AIV的感染能够引起产蛋鸡蛋清中蛋白含量的降低，出现蛋清稀薄现象。 2．实时荧光定量PCR检测产蛋鸡感染H9N2AIV后，输卵管膨大部OVA基因mRNA表达量的变化。结果显示，感染后1天OVA基因mRNA表达量急速上升达对照组的11.78倍，差异显著（P＜0.05）;感染后3天，OVA基因mRNA表达量下降为对照组的1.18倍;感染后5天，OVA基因mRNA表达量继续下降，仅为对照组的0.01倍;感染后第7天，OVA基因mRNA表达量稍有回升达对照组的0.05倍。蛋鸡感染H9N2AIV后7天内，输卵管膨大部OVA基因mRNA表达量表现出先升高后降低的趋势。研究表明，H9N2亚型禽流感病毒感染产蛋鸡后，蛋清中蛋白含量降低与OVA基因mRNA表达量下调有密切关系。

关键词： H9N2禽流感病毒卵清蛋白基因输卵管实时荧光定量PCR 蛋鸡

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卵清蛋白基因结构的音乐分析

东北农业大学学报 1992年第1期 104-104页

作者：郭荣昌东北农学院畜牧系

本世纪80年代,国外一些科学工作者用不同音高标记核酸4种碱基,发现 DNA 序列具有音乐性。日本癌症研究中心林健志,宗像信生,美国加州大学 O.W.蒂马等人就基因的某些序列做过初步的声学比较研究。

关键词：卵清蛋白基因碱基序列基因分子

鹅卵清蛋白基因5’端调控区的克隆和序列分析

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生物技术 2004年第4期14卷 2-4页

作者：朱新产张廷荣莱阳农学院生命科学学院山东莱阳265200

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出 1 2kb的鹅清蛋白基因 5’端调控区 ,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点 (标记为pOV) ,经酶切和测序鉴定 :扩增产物只有 3个碱基发生了突变 ,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子... 详细信息

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出 1 2kb的鹅清蛋白基因 5’端调控区 ,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点 (标记为pOV) ,经酶切和测序鉴定 :扩增产物只有 3个碱基发生了突变 ,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异 ,表明鹅清蛋白基因 5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。

关键词：鹅卵清蛋白基因上游调控区克隆

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输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡制备

中国兽医学报 2023年第9期43卷 1859-1865页

作者：张自富胡静赵瑜秦清明麻冰洁赵聘陈思睿赵云焕信阳农林学院动物科技学院河南信阳464000 中国农业大学动物科技学院畜禽育种国家工程实验室北京100193

艾塞那肽(exenatide)是从墨西哥巨蜥蜴毒液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽序列,与胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide 1,GLP-1)具有53%的同源性,与GLP-1同作用于G-蛋白偶联受体,是首个获准上市的肠促胰岛素类似物抗糖尿病药... 详细信息

艾塞那肽(exenatide)是从墨西哥巨蜥蜴毒液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽序列,与胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide 1,GLP-1)具有53%的同源性,与GLP-1同作用于G-蛋白偶联受体,是首个获准上市的肠促胰岛素类似物抗糖尿病药物。本试验构建了一个基于复制缺陷型慢病毒载体,该载体由一个克隆约2.8kb的鸡卵清蛋白基因特异性启动子调控表达的艾塞那肽基因cDNA(117bp)序列,并在鸡卵清蛋白基因特异启动子上游添加一段雌激素响应受体(estrogen response elements,ERE)(675bp)序列。利用实验室建立的生产转基因家禽技术平台,通过显微注射法把包装好的高滴度慢病毒载体注入发育至第1415期鸡胚卵黄外周静脉血管,获得生殖系嵌合的G0代鸡,扩繁后对G1代和G2代转基因鸡进行分子生物学检测,并对G2代母鸡蛋清中的艾塞那肽含量进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。试验结果显示G1代有5只转基因鸡,均为单拷贝插入;G2代母鸡蛋清中的艾塞那肽平均表达量为45.19g/L。免疫组织化学检测结果显示艾塞那肽仅在输卵管上皮组织特异性表达。本试验建立了一种慢病毒载体介导的血管显微注射法制备转基因鸡的方便快捷、高效稳定的新型技术体系,为利用鸡输卵管生物反应器生产具有重要价值的药用蛋白提供了一种新方法,具有重要的商业价值和应用前景。

关键词：艾塞那肽转基因鸡慢病毒载体卵清蛋白基因

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不连续基因和RNA的拼接

青海医学院通讯 1979年第2期 1-8页

作者：刘义正

高等生物及其病毒有好些基因表现出不连续性,亦即在有意义的 DNA 顺序中间介以'无意义'的 DNA 片段。细胞产生的 RNA,一开始还是这种包含有无意义片段的 DNA的完整转录,然后,将无意义的片段切除,再送至胞桨。本文就所知有关插入序列及 ... 详细信息

高等生物及其病毒有好些基因表现出不连续性,亦即在有意义的 DNA 顺序中间介以'无意义'的 DNA 片段。细胞产生的 RNA,一开始还是这种包含有无意义片段的 DNA的完整转录,然后,将无意义的片段切除,再送至胞桨。本文就所知有关插入序列及 RNA加工的现状作简要介绍,其可能的应用以及如何在进化过程中出现,也付带加以讨论。

关键词： RNA DNA 序列不连续基因 mRNA 卵清蛋白基因隔子