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卵形鲳鲹CD28共刺激信号通路相关基因克隆与表达分析

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卵形鲳鲹CD28共刺激信号通路相关基因克隆与表达分析

作者：何金全广西大学

学位级别：硕士

T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分,其完全激活不仅需要T细胞表面受体提供第一信号,而且需要CD28共刺激受体提供第二个信号,才能充分使其活化。CD28共刺激信号通过招募Grb2,后者通过与Vav1和SLP-76相互作用,介导下游信号级联传递,... 详细信息

T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分,其完全激活不仅需要T细胞表面受体提供第一信号,而且需要CD28共刺激受体提供第二个信号,才能充分使其活化。CD28共刺激信号通过招募Grb2,后者通过与Vav1和SLP-76相互作用,介导下游信号级联传递,增强T细胞的激活和分化,在调节免疫反应中发挥重要作用。卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国南方重要的海水养殖鱼类。随着卵形鲳鲹养殖业的不断扩大,病害问题逐年增加,严重威胁到卵形鲳鲹的健康养殖。本研究从健康卵形鲳鲹的脾脏组织克隆获得卵形鲳鲹CD28、Grb2、Vav1和SLP-76基因(命名为TroCD28、TroGrb2、TroVav1和TroSLP-76)全长序列并进行生物信息学分析;利用荧光定量PCR分析TroCD28、TroGrb2、TroVav1和TroSLP-76在健康组织和免疫刺激后的组织的表达量变化;运用亚细胞定位和Co-IP探究TroCD28、TroGrb2和TroSLP-76在HEK-293T细胞中的定位及相互作用;最后通过原核表达系统对TroCD28胞外域、TroGrb2和TroSLP-76进行蛋白表达。本研究的主要结果如下:(1)TroCD28、TroGrb2、TroVav1、TroSLP-76基因全长分别为1362bp、1580 bp、2861 bp和2373 bp,分别编码248、217、844和375个氨基酸;4个基因的推定氨基酸包含与其他脊椎动物相似的保守基序;同源性分析表明,TroCD28、TroGrb2、TroVav1、TroSLP-76均与其他鱼类同源氨基酸序列相似度高,分别为68.95%～25.00%、100%～93.09%、95.73%～76.71%和92.90%～30.22%。系统发育树分析显示,TroCD28、TroGrb2、TroVav1和TroSLP-76与鱼类聚为一枝。这表明4个基因在不同鱼类中相对保守。(2)qRT-PCR分析显示,TroCD28、TroGrb2、TroVav1和TroSLP-76在卵形鲳鲹的所有检查组织中表达,但它们的转录水平在不同组织中不同,其中TroCD28在鳃中的表达最高,TroGrb2和TroVav1在脾脏中表达最高,TroSLP-76在肠道中的表达量最高;(3)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、多聚肌胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid,poly I:C)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)刺激后,TroCD28和TroGrb2在头肾和脾脏中的表达量显著上升。在PBLs,TroCD28被LPS和Poly I:C诱导显著上升,但V.alginolyticus刺激后无明显变化。TroGrb2在LPS刺激后24 h的PBLs显著上升,但是Poly I:C和V.alginolyticus刺激后无明显变化。LPS、Poly I:C和V.alginolyticus刺激后,TroVav1在脾脏和PBLs显著上升。在头肾中,TroVav1可以被LPS、Poly I:C诱导表达,但V.alginolyticus刺激后则无显著变化。LPS、Poly I:C和V.alginolyticus刺激后,TroSLP-76在头肾、脾脏和PBLs显著上调。这表明4个基因均参与了卵形鲳鲹的免疫反应过程。(4)亚细胞定位结果显示,TroCD28定位在细胞膜,TroGrb2和TroSLP-76定位在细胞质;(5)Co-IP结果显示,TroGrb2与TroCD28存在相互作用,但不与TroSLP-76相互作用;(6)通过原核表达获得纯度较高的TroCD28胞外域、TroGrb2和TroSLP-76重组蛋白,为进一步制备抗体,研究它们的配体和功能奠定基础。综上所述,本研究结果将为更深入地研究卵形鲳鲹T细胞活化机制,制定病害防控新策略和抗病育种奠定理论基础。

关键词：卵形鲳鲹 CD28 Grb2 Vav1 SLP-76 共刺激信号基因克隆

卵形鲳鲹Kiss1基因组结构特征及饵料类型对其表达的影响

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水产学报 2019年第4期43卷 707-718页

作者：梁银银张健郭华阳朱克诚郭梁张楠刘宝锁杨静文张殿昌中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室上海海洋大学水产与生命学院广东海大集团股份有限公司广东省海洋生物种业工程技术研究中心

Kiss基因编码的kisspeptin多肽是脊椎动物重要的神经激素,在调控机体生长发育、能量代谢和生殖活动中发挥重要作用。为了明确卵形鲳鲹Kiss1 (ToKiss1)基因序列及饵料类型对其表达的影响,实验利用RACE方法克隆分析了ToKiss1基因结构特征... 详细信息

Kiss基因编码的kisspeptin多肽是脊椎动物重要的神经激素,在调控机体生长发育、能量代谢和生殖活动中发挥重要作用。为了明确卵形鲳鲹Kiss1 (ToKiss1)基因序列及饵料类型对其表达的影响,实验利用RACE方法克隆分析了ToKiss1基因结构特征,荧光定量PCR (qRT-PCR)方法研究了饵料类型对ToKiss1 mRNA表达调控的影响。结果显示,ToKiss1基因全长2 768 bp,由3个外显子和2个内含子组成。ToKiss1基因cDNA全长505 bp,开放阅读框312 bp,编码104个氨基酸,包括信号肽序列和典型的kisspeptin-10结构域"YNLNSFGLRY"。卵形鲳鲹ToKiss1蛋白三级结构由2个α螺旋和无规则卷曲构成。qRTPCR表达分析结果显示,ToKiss1 mRNA在卵形鲳鲹脑、肠道、胃、脾脏、肌肉和心脏中均有表达,在脑中的表达量最高。饵料类型显著影响ToKiss1 mRNA在卵形鲳鲹肠道组织中的表达,颗粒饲料组表达量最高,其次为冰杂鱼组,冰鱿鱼组表达量最低,但饵料类型对肝脏组织中ToKiss1 mRNA的表达无显著影响,表明ToKiss1在卵形鲳鲹消化吸收过程中发挥了重要调控作用。该研究首次探讨了饵料类型对硬骨鱼肝脏和肠道组织中Kiss1 mRNA表达的影响,为深入研究硬骨鱼类Kiss1基因摄食调控生理机制奠定了基础。

关键词：卵形鲳鲹 Kiss1基因序列分析基因表达饵料类型

卵形鲳鲹脂肪酸延长酶(Elovl4-like)基因特征与功能研究

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南方水产科学 2019年第3期15卷 76-86页

作者：宋岭朱克诚郭华阳江世贵张殿昌中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室广东广州510300 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 广东省海洋生物种业工程技术研究中心广东广州510300

长链脂肪酸延长酶(elongases of very long chain fatty acids, Elovls)是长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA)生物合成途径中的关键限速酶,能够延长PUFA的碳链。为探究Elovl4在卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) PUFA生物合成中的功能,该研究克隆了卵形鲳鲹Elovl4基因的cDNA序列,命名为ToElovl4-like,其开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸。生物信息学分析结果表明,编码的氨基酸包含Elovl家族的显著结构特征如组氨酸盒子、多个跨膜区和ER滞留信号等。序列比对结果显示,卵形鲳鲹Elovl4-like基因高度保守,且该基因编码的蛋白序列与其他鱼类的相似度为73%~86%,其中与大西洋鳕(Gadus morhua)的相似度最高(86%)。系统进化分析表明,Elovl4主要聚为Elovl4a、Elovl4b和Elovl4-like 3类。其中ToElovl4-like与其他鱼类的Elovl4-like亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明ToElovl4-like基因在各组织中均有表达,其中在性腺和脾中mRNA表达量最高,在脑中mRNA表达量最低。酵母异源表达分析表明,ToElovl4-like可以分别将亚油酸(18:2n-6)、二十碳五烯酸(20:5n-3)延长为二十碳二烯酸(20:2n-6)和二十二碳五烯酸(22:5n-3)。研究结果为了解鱼类长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的生物合成提供了理论基础。

关键词：卵形鲳鲹 Elovl4-like 异源表达功能鉴定

饲料中添加丁酸梭菌对卵形鲳鲹幼鱼生长性能和肠道菌群的影响

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南方水产科学 2022年第3期18卷 155-162页

作者：吴杨杨铿黄小林周传朋徐创文黄忠虞为荀鹏伟黄健彬麦晓勇林黑着河北农业大学河北秦皇岛066003 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点实验室广东广州510300 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地广东深圳518121 广州市欣海利生生物科技有限公司广东广州510300 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

研究了饲料中拌料添加丁酸梭菌(Clostridium butyricum)对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼生长性能和肠道菌群的影响,以期为丁酸梭菌在卵形鲳鲹养殖中的应用提供理论依据。设计了5组饲料,在基础饲料中分别添加0、1%(1×10^(7)CFU·g^(... 详细信息

研究了饲料中拌料添加丁酸梭菌(Clostridium butyricum)对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼生长性能和肠道菌群的影响,以期为丁酸梭菌在卵形鲳鲹养殖中的应用提供理论依据。设计了5组饲料,在基础饲料中分别添加0、1%(1×10^(7)CFU·g^(−1))、2%(2×10^(7)CFU·g^(−1))、3%(3×10^(7)CFU·g^(−1))、4%(4×10^(7)CFU·g^(−1))的丁酸梭菌菌液饲喂卵形鲳鲹幼鱼8周。结果表明,饲料中添加2%丁酸梭菌可以显著提高卵形鲳鲹幼鱼的饲料利用率,肠道菌群群落的多样性最大,与对照组和4%添加组有显著差异(P卵形鲳鲹幼鱼肠道菌群结构的主要因素。在门水平和属水平上,实验组与对照组均表现出不同程度的差异。饲料中添加丁酸梭菌能提高卵形鲳鲹幼鱼的生长性能、改善其肠道健康状态。

关键词：卵形鲳鲹丁酸梭菌生长性能肠道菌群

卵形鲳鲹MyoG基因克隆及其胚胎组织表达分析

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南方农业学报 2020年第12期51卷 3090-3098页

作者：张永德冯鹏霏余艳玲潘传燕宋漫玲肖蕊罗洪林广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室南宁530021

【目的】明确卵形鲳鲹胚胎发育中肌细胞生成素基因(MyoG)的表达规律,为阐明MyoG在卵形鲳鲹胚胎生长发育中的作用机制打下基础。【方法】采用RT-PCR扩增卵形鲳鲹MyoG基因全长序列,通过ProtParam、GOR IV、SWISS-MODEL、TMHMM、SignalP、P... 详细信息

【目的】明确卵形鲳鲹胚胎发育中肌细胞生成素基因(MyoG)的表达规律,为阐明MyoG在卵形鲳鲹胚胎生长发育中的作用机制打下基础。【方法】采用RT-PCR扩增卵形鲳鲹MyoG基因全长序列,通过ProtParam、GOR IV、SWISS-MODEL、TMHMM、SignalP、PSORT及NetNGlyc 1.0等在线软件对其进行生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR检测MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期(受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、胚胎形成期、眼囊期、耳囊期、心脏跳动期、晶体出现期和孵化期)的表达情况。【结果】从卵形鲳鲹胚胎组织中克隆获得的MyoG基因全长为1379 bp,编码233个氨基酸残基,其蛋白分子量为26059.19 Da,理论等电点(pI)为8.72;不稳定指数为75.23,即MyoG蛋白稳定性较差;总平均疏水指数(GRAVY)为-0.764,属于亲水性蛋白。卵形鲳鲹MyoG蛋白无跨膜结构,无信号肽序列,在第49位氨基酸处存在1个潜在的糖基化位点;卵形鲳鲹MyoG蛋白主要存在于细胞质和微体中,不属于分泌蛋白,其二级结构中以无规则卷曲占比最高(59.23%),其次为α-螺旋(21.46%)和延伸链(19.31%)。MyoG基因相对表达量在卵形鲳鲹胚胎发育过程中呈明显的先升高后降低变化趋势。其中,在胚胎发育的前期(受精卵至胚体形成期)MyoG基因相对表达量极低,但从眼囊期开始其相对表达量迅速升高,至心脏跳动期达最高值;眼囊期、耳囊期和心脏跳动期3个时期的MyoG基因相对表达量均极显著高于胚胎发育前5个时期(P卵形鲳鲹眼囊期、耳囊期和心脏跳动期的分化形成过程中发挥重要作用外,在卵形鲳鲹胚胎器官分化形成后仍发挥着重要作用。

关键词：卵形鲳鲹 MyoG基因胚胎发育生物信息学表达分析

发酵棉籽粉替代鱼粉对卵形鲳鲹幼鱼生长、饲料利用性能及肠道菌群的影响

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南方水产科学 2023年第4期19卷 126-138页

作者：吴光德兰鲲鹏陈旭王芸周传朋林黑着马振华王珺上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室广东广州510300 中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心海南三亚572018 海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室海南三亚572018

发酵棉籽粉是一种优质植物蛋白原料,具有替代饲料鱼粉的潜力。为评估发酵棉籽粉作为卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)饲料蛋白源的适宜性及适宜替代水平,用发酵棉籽粉分别替代卵形鲳鲹幼鱼饲料中0%(对照组)、25%、50%、75%和100%的鱼粉(基... 详细信息

发酵棉籽粉是一种优质植物蛋白原料,具有替代饲料鱼粉的潜力。为评估发酵棉籽粉作为卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)饲料蛋白源的适宜性及适宜替代水平,用发酵棉籽粉分别替代卵形鲳鲹幼鱼饲料中0%(对照组)、25%、50%、75%和100%的鱼粉(基础饲料中鱼粉质量分数为35%),配制成5种实验饲料,饲喂幼鱼[初始体质量为(12.57±0.25)g]7周,探究了发酵棉籽粉替代鱼粉对幼鱼存活、生长和饲料利用性能及肠道菌群组成的影响。结果显示,发酵棉籽粉替代组的存活、生长、饲料利用率以及蛋白质、脂肪沉积效率均低于鱼粉对照组,而25%和50%替代组与对照组无显著性差异(P>0.05)。但当发酵棉籽粉替代75%~100%鱼粉时,刺激了卵形鲳鲹肝脏的抗氧化系统,使总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性高于对照组。此外肝脏HE染色切片显示其细胞空泡化现象加剧,100%替代组的血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量降低,肝脏合成蛋白能力可能下降。发酵棉籽粉高水平替代鱼粉会影响卵形鲳鲹的肠道菌群组成,表现为有益菌丰度下降、有害菌丰度上升,从而影响了肠道菌群功能。综合考虑生长性能和鱼体健康,建议卵形鲳鲹饲料中发酵棉籽粉替代鱼粉水平以25%为宜。

关键词：卵形鲳鲹发酵棉籽粉生长饲料利用肠道菌群

荚膜甲基球菌蛋白替代鱼粉对卵形鲳鲹生长和抗氧化能力的影响

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水生生物学报 2023年第2期47卷 195-203页

作者：高文浩彭树锋廖春燕董晓慧谭北平王嘉迟淑艳广东海洋大学水产经济动物营养与饲料实验室湛江524088 中国渔业协会金鲳鱼分会湛江524000 恺勒司(上海)商务信息咨询有限公司上海200060

实验旨在研究荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus, Bath)蛋白(MBM,斐康?蛋白)替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能和抗氧化能力的影响。MBM添加量分别为0、3.5%、7%和10.5%,替代基础饲料中鱼粉(含量35%)0、10%、20%和30%,制得4组等氮等脂饲... 详细信息

实验旨在研究荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus, Bath)蛋白(MBM,斐康?蛋白)替代鱼粉对卵形鲳鲹生长性能和抗氧化能力的影响。MBM添加量分别为0、3.5%、7%和10.5%,替代基础饲料中鱼粉(含量35%)0、10%、20%和30%,制得4组等氮等脂饲料,即MBM0、MBM10、MBM20和MBM30组,饲喂卵形鲳鲹幼鱼[初始均重(34.88±1.13) g]56d。实验结果显示,随着饲料中MBM含量的升高,各组间的末均重、增重率、特定生长率、存活率、肝体比、脏体比和饲料系数均无显著性差异(P>0.05)。MBM30组肥满度显著高于MBM0组(P0.05), MBM20组全鱼粗脂肪含量显著高于MBM0组和MBM10组(P0.05),显著高于MBM10和MBM30组(P卵形鲳鲹的生长性能、形态学指标、体成分和血清生化指标产生负面影响。

关键词：荚膜甲基球菌蛋白替代鱼粉生长性能抗氧化能力卵形鲳鲹

卵形鲳鲹生长抑素家族基因的全基因组鉴定及组织表达特征分析

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南方农业学报 2021年第12期52卷 3212-3220页

作者：余艳玲冯鹏霏潘传燕林勇宋漫玲张永德罗洪林广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室南宁530021

【目的】明确卵形鲳鲹生长抑素(SST)家族基因的种类及其组织表达特征,为进一步揭示SST家族基因在其生长发育过程中的作用机制打下基础。【方法】采用HMMER 3.1对卵形鲳鲹全基因组数据进行搜索,然后通过Pfam、SMART及NCBI CDD等数据库确... 详细信息

【目的】明确卵形鲳鲹生长抑素(SST)家族基因的种类及其组织表达特征,为进一步揭示SST家族基因在其生长发育过程中的作用机制打下基础。【方法】采用HMMER 3.1对卵形鲳鲹全基因组数据进行搜索,然后通过Pfam、SMART及NCBI CDD等数据库确认搜索获得的基因是否属于SST家族基因;采用ProtParam和PSORT等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测SST家族基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况。【结果】从卵形鲳鲹全基因组中共鉴定出4个SST家族基因(SST1、SST3、SST5和SST6),分别编码122、127、106和110个氨基酸残基,对应的编码蛋白分子量介于12249.3~14316.1 Da,理论等电点(pI)介于6.51~7.43,均定位于细胞外。4个卵形鲳鲹SST基因结构较简单且相似,均包含2个外显子和1个内含子;SST1和SST3基因位于7号染色体上,SST6和SST5基因则分别位于8号和23号染色体上;4个卵形鲳鲹SST氨基酸序列相似性的平均值为33.42%,以SST5氨基酸序列与SST6氨基酸序列的相似性最高(39.78%),SST3氨基酸序列与SST5氨基酸序列的相似性最低(28.16%)。SST家族基因在卵形鲳鲹脑、胃、性腺和肌肉等组织中均有不同程度的表达,SST1、SST3和SST6基因在脑组织中显著高表达(P卵形鲳鲹卵巢中的相对表达量均显著高于在精巢中的相对表达量。【结论】从卵形鲳鲹基因组中鉴定出4个SST家族基因(SST1、SST3、SST5和SST6),其表达分布存在组织特异性和种属特异性,可能介导卵形鲳鲹的神经调节、性腺发育及性二型性等多种生理功能,且不同物种的SST基因功能可能存在差异。

关键词：卵形鲳鲹生长抑素(SST)家族基因基因结构基元(Motif) 组织表达

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

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南方农业学报 2021年第1期52卷 238-244页

作者：段家文乔瑞峰雷坤杨萌陆专灵韦友传广西大学动物科学技术学院南宁530005 广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室南宁530021

【目的】制备卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)RelB蛋白(TroRelB)多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌(Esc... 详细信息

【目的】制备卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)RelB蛋白(TroRelB)多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清(多克隆抗体),ELISA检测结果显示其抗体效价为1∶256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照(免疫前血清)未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的Tro RelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。

关键词：卵形鲳鲹 RelB蛋白原核表达重组蛋白多克隆抗体