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抗Cry1Ac棉铃虫的卵巢发育与卵黄原蛋白基因的表达动态

抗Cry1Ac棉铃虫的卵巢发育与卵黄原蛋白基因的表达动态

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作者：张万娜中国农业科学院

学位级别：硕士

我国自从1997年开始种植转基因棉花后，有效地控制了棉铃虫Helicoverpa armigera （Hübner）的危害。但由于Bt蛋白在棉株内持续表达，使得棉铃虫一直处于Bt蛋白的选择压力下，因此棉铃虫对Bt的抗性问题已成为影响Bt棉花持续利用的关键... 详细信息

我国自从1997年开始种植转基因棉花后，有效地控制了棉铃虫Helicoverpa armigera （Hübner）的危害。但由于Bt蛋白在棉株内持续表达，使得棉铃虫一直处于Bt蛋白的选择压力下，因此棉铃虫对Bt的抗性问题已成为影响Bt棉花持续利用的关键因素。棉铃虫对Bt产生抗性后也存在一定的适合度代价，但引起这种适合度代价的内在原因一直没有明确。卵黄原蛋白（Vitellogenin, Vg）的合成和摄取是卵黄发生的关键步骤，卵黄发生（Vitellogenesis）控制昆虫卵巢的成熟，直接影响昆虫的繁殖力。因此，本文比较了棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后，其卵巢发育、卵黄原蛋白基因表达量的变化，这些结果不仅有助于深入理解棉铃虫的生殖分子机制、适合度产生的内在机制，而且可以为探讨抗性演替模式、完善抗性治理策略提供理论依据。主要结果如下： 1.利用光学解剖镜和透射电镜观测了棉铃虫Cry1Ac敏感品系（96S）雌虫的卵巢，简化了分级标准。首次对棉铃虫的卵子发生过程进行了分级，从超微结构对棉铃虫的卵母细胞形成进行了分析，明确了卵母细胞形成时卵黄蛋白颗粒的沉积情况。比较了敏感品系96S和Cry1Ac抗性品系棉铃虫卵巢发育的差异,研究发现抗性品系的卵巢管长度、成熟卵比率和卵巢比重等都显著低于敏感品系;而且抗性品系棉铃虫卵子内部细胞核、线粒体、卵黄沉积、微绒毛等都发生了变化。 2.克隆了棉铃虫卵黄原蛋白Vg的基因全长，命名为HaVg （基因登录号: JX504706），其全长为5704bp，ORF为5265bp，编码1765氨基酸。Vg氨基酸序列含有Vitellogenin-N，DUF1943和VWD3个保守区域，一条19个氨基酸的信号肽和一个卵裂位点RARR，一段多聚丝氨酸区，C-末端有高度保守的GL/ICG，DGXR和半胱氨酸残基（C）。通过软件分析表明棉铃虫Vg蛋白无跨膜结构。HaVg翻译成蛋白质理论分子量为198.73kDa，预测等电点为8.75。HaVg mRNA只在雌性棉铃虫中表达，且在雌性脂肪体中表达量最高。在脂肪体中羽化后48h表达量最高，随后开始下降。 3.利用q-RT PCR的方法比较了不同品系棉铃虫在不同发育时期的HaVg mRNA表达量的差异，发现不同品系中HaVg基因mRNA的表达趋势不同：与敏感品系96S相比，Cry1Ac高抗品系（BtR）棉铃虫mRNA表达有明显的滞后现象，96S雌性成虫的HaVg基因mRNA在羽化后第3天表达量达到最高峰，而BtR抗性品系表达量的最大值出现在第7天且其表达量仅为96S敏感品系的50%;在抗性品系消除选择压力38代后（CK1）,其HaVg的表达与96S品系具有相似的趋势;而BtR抗性幼虫在正常饲料上饲养1代后（CK2）和BtR的趋势一致。这说明棉铃虫对Bt产生抗性后卵黄原蛋白Vg基因在转录水平发生较大变异综上所述，棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后，表现出产卵量降低、卵孵化率降低等适合度代价，抗性棉铃虫卵巢管长度、成熟卵比率和卵巢比重等都明显降低，HaVg的表达量也明显降低、表达高峰延迟;在选择压力消除后，棉铃虫敏感性、适合度和其HaVg的表达量逐渐恢复。因此，卵巢发育、HaVg表达与棉铃虫对Cry1Ac的抗性适合度代价有明显关系。

关键词：棉铃虫 Bt抗性适合度代价卵巢管结构卵黄原蛋白

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红颈常室茧蜂卵巢发育及其生殖相关蛋白研究

红颈常室茧蜂卵巢发育及其生殖相关蛋白研究

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作者：夏亚运海南大学

学位级别：硕士

红颈常室茧蜂是一种盲蝽若虫优势内寄生蜂。目前对该蜂是生殖生理研究较少,本文对红颈常室茧蜂蛹期的发育形态学及卵巢发育进行了研究,同时对不同温度饲养条件下不同日龄的雌蜂的生殖系统,卵巢的结构和卵子发生的状况进行了研究比较;并... 详细信息

红颈常室茧蜂是一种盲蝽若虫优势内寄生蜂。目前对该蜂是生殖生理研究较少,本文对红颈常室茧蜂蛹期的发育形态学及卵巢发育进行了研究,同时对不同温度饲养条件下不同日龄的雌蜂的生殖系统,卵巢的结构和卵子发生的状况进行了研究比较;并且利用电子显微镜对卵巢及卵子超微结构的进行研究和观察了该蜂生殖系统内各器官的形态、构造及与功能的关系。通过蛋白电泳的分析及蛋白质组学对红颈常室茧蜂卵巢蛋白进行蛋白质鉴定、蛋白基因产物的分类状况及生物学功能研究。本研究获得的主要结果如下:1、利用光学显微镜对红颈常室茧蜂蛹发育进度研究发现:该蜂是一种卵育型寄生蜂,雌虫在未羽化前4d卵巢就已经开始发育,并且羽化后期卵巢管内已有少量的成熟卵粒。蛹后期(10-14d)可以通过幼虫体表颜色的变化或腹部末端的形状区分雌雄。2、该蜂85%卵巢是由6-8对卵巢管组成(N>100)。23℃和15℃条件下卵巢中成熟的卵子数随日龄的增加而不断增加,且23 ℃条件下卵巢中平均每根卵巢管的卵子总数高于15 ℃条件下的。雌蜂在羽化前期(1 - 3 d)解剖时时卵巢内的成熟的卵粒数量较少,卵巢管内含有大量的卵原细胞,卵子内充满了大量的脂滴,中后期(5-11d)随着脂肪体的降解吸收,卵子内逐渐新生一些细胞器线粒体、高尔基体等。这些细胞器的数量开始逐渐增多,活力增强。卵子内存在大量的滋养细胞,其中滋养细胞为卵母细胞发育供给必要的营养元素。从超微结构图中可以看出在整个卵巢发育的过程中,没有发现卵黄原蛋白颗粒的产生及运输过程。3、根据红颈常室茧蜂卵巢蛋白电泳的分析得出红颈常室茧蜂成虫约有20条蛋白条带位于15 - 260 KD之间,卵巢的蛋白条带要少成虫的主要集中在25 KD-120 KD之间,通过进行蛋白质谱分别鉴定出1382个蛋白,除去冗余蛋白总共鉴定了 1190个非冗余蛋白,在80 KD胶条处鉴定出一段卵黄原蛋白多肽片段。对该蜂的卵巢表达蛋白进行生物信息学分析,明确了红颈常室茧蜂卵细胞形成相关的功能蛋白与生物学路径。生物学路径分析发现细胞组成cell part、代谢过程metabolic process、催化功能catalytic activity蛋白在卵巢中较为丰富。通过KEGG pathway在卵巢中分析发现遗在传信息处理中参与转录Transcription的蛋白最多。

关键词：红颈常室茧蜂蛹卵巢超微结构卵巢管结构卵黄原蛋白蛋白质组

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