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条石鲷促性腺激素β(FSH,LH)亚基cDNA克隆及表达特性分析

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水产学报 2014年第10期38卷 1673-1686页

作者：陈圣毅柳学周史宝徐永江李晓晓王珊珊臧坤中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了条石鲷GtHβcDNA序列,并分析了GtHβmRNA在条石鲷组织中的表达差异和在卵巢发育不同时期的垂体、卵巢、脑中表达水平变化。结果发现,条石鲷FSH cDNA全长554 bp,ORF长363 bp,编码了120... 详细信息

采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了条石鲷GtHβcDNA序列,并分析了GtHβmRNA在条石鲷组织中的表达差异和在卵巢发育不同时期的垂体、卵巢、脑中表达水平变化。结果发现,条石鲷FSH cDNA全长554 bp,ORF长363 bp,编码了120个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽。条石鲷LH cDNA全长857 bp,ORF长450 bp,编码了149个氨基酸,前24个氨基酸为信号肽。FSH和LH包含了12个保守的半胱氨酸残基(Cys)和一个N-糖基化位点,在LH的第4和第5个Cys之间存在着硬骨鱼类特异性的Cys-Ser-Gly-His(CSGH)区域。同源性比较和进化分析显示,条石鲷FSH和LH与鲈形目鱼类的进化关系较近。采用实时荧光定量PCR法检测发现,FSH mRNA和LH mRNA在垂体中的表达量最高,其次是性腺;FSH mRNA在头肾和肾脏中不表达,LH mRNA在头肾中不表达。周期表达分析显示,垂体中的FSH mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,LH mRNA在Ⅴ期达到最大值;卵巢中的FSH mRNA在Ⅴ期达到最低值,而LH mRNA在Ⅴ期达到最大值;脑中的FSH和LH mRNA在Ⅴ期达到最低值。激素分析显示,血清中FSH在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,而LH在Ⅴ期达到最大值,血清中FSH和LH水平与垂体中FSH mRNA和LH mRNA表达趋势一致。

关键词：条石鲷促性腺激素β亚基 cDNA克隆表达卵巢发育周期

条石鲷促性腺激素α亚基的克隆与表达特性分析

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海洋科学进展 2015年第2期33卷 207-218页

作者：陈圣毅史宝柳学周徐永江李晓晓王珊珊王妍妍中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室山东青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增（RACE）方法,从条石鲷（Oplegnathidae fasciatus）垂体中获得了全长为897bp的GtHαcDNA序列,其中包含249bp的5′非编码区、399bp的开放阅读框和249bp的3′非编码区。该基因编码由132个氨基酸组成的... 详细信息

采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增（RACE）方法,从条石鲷（Oplegnathidae fasciatus）垂体中获得了全长为897bp的GtHαcDNA序列,其中包含249bp的5′非编码区、399bp的开放阅读框和249bp的3′非编码区。该基因编码由132个氨基酸组成的前体蛋白,其中前38个氨基酸为信号肽,在第122和124Cys中间间隔了一个组氨酸（His）,形成CXC型趋化因子的特征结构,肽链中包括10个保守Cys残基和2个N-糖基化位点。氨基酸同源性和进化分析表明,条石鲷GtHα与鲈形目鱼类的进化关系较近,与鲈形目鱼类GtHα的同源性为87%-98%,与其他脊椎动物GtHα的同源性为53%-87%。实时荧光定量PCR检测发现,GtHαmRNA在垂体、脑、性腺中的表达量较高,在心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊中微量表达,在脾脏、头肾、鳃、肾脏中不表达,其中在垂体中的表达量最高;周期表达发现：垂体中GtHαmRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值,卵巢中GtHαmRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值,而脑组织中GtHαmRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值,表明GtHα对卵母细胞发育的调控可能同时通过自分泌和旁分泌两种途径进行。本研究为条石鲷生殖调控机制及人工繁育技术研究提供了基础资料。

关键词：条石鲷促性腺激素α亚基 cDNA克隆表达卵巢发育周期

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漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LHβ基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

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渔业科学进展 2014年第4期35卷 22-31页

作者：柳学周臧坤徐永江李春广史宝王妍妍农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。

关键词：漠斑牙鲆 LHβ亚基卵巢发育周期表达特性血浆激素浓度

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条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析

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条石鲷促性腺激素基因的克隆、表达和性类固醇激素分析

作者：陈圣毅上海海洋大学

学位级别：硕士

本文以人工培育的条石鲷（Oplegnathus fasciatus）为研究对象，运用组织学、同源性克隆和RACE克隆法、放射免疫测定（RIA）法等技术手段，对条石鲷卵巢各发育期特征、促性腺激素（GonadotropinHormone, GtH）和膜孕激素受体（membrane ... 详细信息

本文以人工培育的条石鲷（Oplegnathus fasciatus）为研究对象，运用组织学、同源性克隆和RACE克隆法、放射免疫测定（RIA）法等技术手段，对条石鲷卵巢各发育期特征、促性腺激素（GonadotropinHormone, GtH）和膜孕激素受体（membrane progestin receptor，mPRα）cDNA全长的克隆、在组织表达特性和卵巢发育不同时期的表达特性、血清中促性腺激素在繁殖周期中的变化规律等进行了研究，为深入认识条石鲷生殖调控机制提供了理论支撑。本研究结果为全面揭示条石鲷生殖调控机制以及繁殖调控研究提供了丰富的基础资料。相关结果如下：1.条石鲷促性腺激素α（GtHα）亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和cDNA末端快速扩增（RACE）方法，从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)垂体中获得了全长为897bp的GtHα cDNA序列，其中包含249bp的5’非编码区、399bp的开放阅读框和249bp的3’非编码区。其ORF编码132个氨基酸，前38个氨基酸为信号肽。肽链中包括10个保守Cys残基和2个N-糖基化位点，在第122和124Cys中间间隔了一个组氨酸（His），形成CXC型趋化因子的特征结构。此外，在3’端末端含有一个加尾信号ATTAAA。其预测蛋白分子量为14.59KDa，预测等电点为8.41。氨基酸同源性和进化分析表明，条石鲷GtHα与鲈形目鱼类的进化关系较近，与鲈鱼的同源性最高为98%。实时荧光定量PCR方法检测发现，GtHα mRNA在脑、垂体、卵巢中的表达量较高，在心、肝脏、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达，在脾脏、头肾、鳃、肾脏中不表达，其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明，垂体中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值，卵巢中GtHα mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值，而脑组织中GtHαmRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。2.条石鲷促滤泡激素β（FSHβ）亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)垂体中获得了全长为554bp的FSHβ cDNA序列。其中开放阅读框长363bp，编码了含120个氨基酸的蛋白，其中前18个氨基酸为信号肽。肽链中含了12个保守的Cys残基和一个N-糖基化位点（NIS），在第255和第257半胱氨酸中间间隔了一个谷氨酸，形成CXC型趋化因子的特征结构。此外，在3’端含有一个加尾信号AAATAA。其预测蛋白分子量为12.96KDa，预测等电点为6.05。氨基酸同源性和进化分析表明，条石鲷FSHβ与鲈形目鱼类的进化关系较近，与花鲈的同源性最高为88%。实时荧光定量PCR方法检测发现，FSHβ mRNA在垂体、卵巢中的表达量较高，在脑、心、肝脏、脾脏、鳃、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达，在头肾和肾脏中不表达，其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明，垂体中FSHβ mRNA在卵巢发育的Ⅳ期达到最大值，而卵巢和脑组织中FSHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。3.条石鲷促黄体激素β（LHβ）亚基的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法克隆了条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)LHβ cDNA序列，并分析了LHβ mRNA在雌性条石鲷组织中的表达差异和卵巢发育不同时期卵巢、垂体、脑中表达水平变化。结果表明，条石鲷LHβ基因全长857bp，其中ORF为450bp，编码了149个氨基酸，前24个氨基酸为信号肽，肽链中包含了12个保守的Cys残基和一个N-糖基化位点（NQT），在第4个Cys和第5个半Cys位点之间存在着硬骨鱼类特异性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）区域。此外，在3’端含有一个加尾信号AATAAA。其预测的蛋白分子量为16.56KDa，理论等电点为5.52。氨基酸同源性和进化分析表明，条石鲷LHβ与鲈形目鱼类的进化关系较近，与斜带石斑鱼的同源性最高为98%。实时荧光定量PCR方法检测发现，LHβ mRNA在垂体和卵巢中的表达量较高，在鳃、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、脑、胃、肠、肌肉、幽门盲囊微量表达，在头肾中不表达，其中在垂体中的表达量最高;周期表达表明，垂体和卵巢中LHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最大值，而脑组织中LHβ mRNA在卵巢发育的Ⅴ期达到最低值。4.条石鲷膜孕激素受体（mPRα）的克隆及其表达特性分析采用同源性克隆和RACE方法，从条石鲷(Oplegnathidae fasciatus)卵巢中获得全长为1222bp的mPRα序列。其中开放阅读框为1060bp，编码了含353个氨基酸的蛋白。前16个氨基酸为信号肽。成熟肽部分包

关键词：条石鲷促性腺激素膜孕激素受体 cDNA克隆表达卵巢发育周期放射免疫测定