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武汉市部分地区犬猫弓形虫病流行病学调查及猫卵囊感染ELISA方法的建立

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武汉市部分地区犬猫弓形虫病流行病学调查及猫卵囊感染ELISA方法...

作者：张卜凡华中农业大学

学位级别：硕士

弓形虫是一种专性胞内寄生、在世界范围内都广泛流行的人畜共患寄生虫,从动物到人的传播是人弓形虫病的重要感染途径。了解最常见的伴侣动物——犬、猫的弓形虫病流行情况不仅能够掌握其健康状况,还有助于人们应对弓形虫病的感染风险。... 详细信息

弓形虫是一种专性胞内寄生、在世界范围内都广泛流行的人畜共患寄生虫,从动物到人的传播是人弓形虫病的重要感染途径。了解最常见的伴侣动物——犬、猫的弓形虫病流行情况不仅能够掌握其健康状况,还有助于人们应对弓形虫病的感染风险。猫科动物,包括野生猫科动物和家猫,是弓形虫唯一的终末宿主,弓形虫在其肠道进行有性生殖后形成卵囊随粪便排出是弓形虫病传播的重要环节。同时,猫能够通过摄食含有组织包囊的猎物或被孢子化卵囊污染的水源、食物等途径感染弓形虫。猫弓形虫病感染方式的鉴别诊断对猫弓形虫病的溯源、阻断弓形虫传播及人和其他中间宿主弓形虫病的防控具有重要意义。为调查武汉部分地区犬猫弓形虫病流行病学,本研究在华中农业大学动物医院收集犬、猫血液样品共688份,其中猫315份,犬373份,采用MIC17A-i ELISA-Ig G方法检测猫血液样本,采用改良凝集试验(MAT)检测犬样本,并通过SPSS软件分析犬、猫的品种、性别、年龄与弓形虫感染之间的相关性。调查结果显示,犬弓形虫血清阳性率15.01%(56/373),猫弓形虫血清阳性率46.03%(145/315)。利用SPSS卡方检验分别对血液样品检测结果进行分析,结果显示,犬的品种对弓形虫感染具有极显著的影响,猫的品种对弓形虫的感染没有显著影响。去势/绝育的猫与雌性猫弓形虫血清阳性率具有显著差异(P卵囊时期特异性表达的蛋白TGME49＿226230、Tg LEA880作为候选诊断靶标,成功原核表达并大量纯化TGME49＿226230、Tg LEA880蛋白。经WB验证,Tg LEA880能够与弓形虫卵囊感染猫的阳性血清发生反应,不与弓形虫包囊感染猫的阳性血清及猫弓形虫阴性血清发生反应。因此,Tg LEA880能够作为鉴别猫弓形虫感染方式的ELISA诊断抗原。对建立的ELISA方法的各项反应条件进行优化,确定Tg LEA880蛋白最佳包被浓度为8μg/m L,最佳封闭浓度为0.5%BSA,最佳封闭时间为45 min;最佳一抗血清稀释浓度为1:100,最佳一抗血清孵育时间为45min;最佳二抗稀释浓度为1:5000,最佳二抗作用时间为45 min;最佳显色时间为20 min。应用优化各项反应条件的ELISA方法检测猫泛白细胞减少症阳性血清、猫疱疹病毒阳性血清、猫传染性腹膜炎阳性血清、猫球虫阳性血清,均不与之发生交叉反应。使用本方法检测猫卵囊感染阳性血清,在血清稀释度为1:400时依然能够检测为阳性。以上结果表明,本研究建立的ELISA方法敏感性和特异性良好。使用本研究建立的ELISA方法检测前述收集的猫临床血清样品,与本实验室之前建立的MIC17A-i ELISA-Ig G方法联合使用,共检测117份猫血液样本,其中卵囊感染的猫血液样品15份,包囊感染的猫血液样品39份,说明作为伴侣动物的猫主要的弓形虫感染方式为包囊感染,饲主可通过限制其外出猎食或不给予未煮熟的生肉等措施对此进行防控。

关键词：弓形虫犬猫流行病学调查 ELISA 卵囊 TgLEA880

采用实时PCR技术比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第2期27卷 130-134页

作者：陈盛霞吴亮沈玉娟章秋霞李婷婷姜旭淦徐馀信曹建平中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025 江苏大学基础医学与医学技术学院镇江212013

目的比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果。方法将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司(简称Promega)和上海捷瑞公司(简称捷瑞)基因组DNA纯化试剂盒的裂解液、2%TritonX-100和5%异硫氰酸胍,同时联合使用冻融法、蛋白酶K... 详细信息

目的比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果。方法将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司(简称Promega)和上海捷瑞公司(简称捷瑞)基因组DNA纯化试剂盒的裂解液、2%TritonX-100和5%异硫氰酸胍,同时联合使用冻融法、蛋白酶K法和声裂法裂解卵囊,用试剂盒法或Chelex-100法提纯卵囊基因组DNA,用实时PCR测定隐孢子虫卵囊囊壁蛋白(COWP)基因拷贝数,以Promega试剂盒为参照比较不同纯化方法的提纯效果。结果Promega试剂盒的裂解液裂解隐孢子虫卵囊的效果最好,纯化所得卵囊COWP基因拷贝数可达(6.45～9.86)×106;其他依次为捷瑞试剂盒的裂解液[(2.38～3.69)×106]、5%异硫氰酸胍[(1.27～21.29)×105]和2%TritonX-100[(2.06～866.70)×103]。冻融法+蛋白酶K法+声裂法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果最佳,其次为冻融法+声裂法和蛋白酶K法+声裂法,冻融法+蛋白酶K法效果最差。结论冻融法+蛋白酶K法+声裂法联合使用能使卵囊DNA的提纯效率达到最大,捷瑞基因组DNA纯化试剂盒和5%异硫氰酸胍裂解法提纯隐孢子虫卵囊DNA可获得与Promega试剂盒相近的效果。

关键词：隐孢子虫卵囊实时PCR DNA 提纯

从鼠粪中分离纯化微小隐孢子虫卵囊方法的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2006年第3期24卷 219-222页

作者：陈甫黄克和南京农业大学动物医学院南京210095

目的探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。方法分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐... 详细信息

目的探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。方法分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐孢子虫卵囊。并将4种方法分离纯化获得的卵囊各105体外感染牛输卵管上皮细胞(BFTE),48h和72h后油镜下观察各分离法卵囊的发育情况,以比较卵囊的纯度和活性。结果经典的不连续蔗糖密度梯度离心法分离获得的卵囊数[(2.86±0.08)×107]与改良饱和盐水漂浮法[(2.88±0.15)×107]无明显差异(P>0.05),但高于Percoll密度梯度离心法[(1.52±0.08)×107](P卵囊体外感染BFTE48h和72h后隐孢子虫数无明显差异(P>0.05)。但CsCl密度梯度离心法纯化的隐孢子虫卵囊纯度明显高于不连续蔗糖密度梯度离心法。结论改良饱和盐水漂浮法较经典的不连续蔗糖密度梯度离心法操作简单、快速;CsCl密度梯度离心法分离的隐孢子虫卵囊纯度较高。

关键词：微小隐孢子虫卵囊改良饱和盐水漂浮法 Percoll密度梯度离心法不连续蔗糖密度梯度离心法氯化铯密度梯度离JD法牛输卵管上皮细胞

数字图像处理技术对隐孢子虫卵囊形态学参数的测定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第3期23卷 175-177页

作者：邴玉艳李岩安春丽中国医科大学病原生物学教研室沈阳110001

目的建立并分析小鼠隐孢子虫卵囊的形态学参数,明确小鼠隐孢子虫卵囊的形态学变化特点。方法昆明株小鼠经地塞米松免疫抑制10d后,取粪便涂片、改良抗酸染色法检测小鼠隐孢子虫卵囊。应用摄像系统采集1190个小鼠隐孢子虫卵囊的图像,利用... 详细信息

目的建立并分析小鼠隐孢子虫卵囊的形态学参数,明确小鼠隐孢子虫卵囊的形态学变化特点。方法昆明株小鼠经地塞米松免疫抑制10d后,取粪便涂片、改良抗酸染色法检测小鼠隐孢子虫卵囊。应用摄像系统采集1190个小鼠隐孢子虫卵囊的图像,利用计算机数字图像分析系统测定卵囊的长径(L)、横径(W)、周长、面积和等效直径。用SPSS数据处理软件(V11.0)分析测定各组数据,计算其卵形指数。结果1190个小鼠隐孢子虫卵囊长径均值为5.93μm,95%可信区间为3.31～8.51μm;卵囊横径的均值为4.96μm,95%可信区间为3.26～6.66μm;周长均值为18.03μm;面积的均值为16.08μm2;卵形指数(L/W)为1.19。结论利用计算机显微图像处理系统所获得的小鼠隐孢子虫卵囊形态学参数数据客观、精确,为量化及评价小鼠隐孢子虫卵囊的形态奠定了基础。

关键词：小鼠隐孢子虫卵囊数字图像处理形态学参数

微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第4期23卷 228-230页

作者：沈玉娟曹建平卢潍媛李小红刘海鹏徐馀信周晓农汤林华刘述先中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因... 详细信息

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析。Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性。结果3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊。结论3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测。

关键词：微小隐孢子虫卵囊脱氧核精核酸分离和提纯螯合树脂法聚合酶链反应

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隐孢子虫卵囊DNA纯化方法的研究进展

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第4期27卷 365-367页

作者：吴亮章秋霞李婷婷陈盛霞曹建平江苏大学基础医学与医学技术学院镇江212013 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

PCR技术不仅可检测极微量的隐孢子虫,而且具有高度特异性,在隐孢子虫检测中发挥重要作用。PCR检测中,隐孢子虫卵囊模板DNA的制备尤为重要,需对卵囊进行分离纯化和裂解后才能提取纯化DNA。本文综述目前常用的卵囊分离纯化、裂解和DNA提... 详细信息

PCR技术不仅可检测极微量的隐孢子虫,而且具有高度特异性,在隐孢子虫检测中发挥重要作用。PCR检测中,隐孢子虫卵囊模板DNA的制备尤为重要,需对卵囊进行分离纯化和裂解后才能提取纯化DNA。本文综述目前常用的卵囊分离纯化、裂解和DNA提取纯化的方法。

关键词：隐孢子虫卵囊 DNA 纯化

按蚊TEP1基因与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化反应的相关性

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第4期27卷 322-325页

作者：张健徐文岳段建华黄复生第三军医大学基础部病原生物学教研室重庆400038

目的对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究。方法斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组(各300只),A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10%蔗糖水。另设正常对照组(C组),常规蔗糖水饲养。... 详细信息

目的对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究。方法斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组(各300只),A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10%蔗糖水。另设正常对照组(C组),常规蔗糖水饲养。分别于用药后第1、2、3和4天,取各组雌蚊的血淋巴(各50只),提取cDNA模板,设计引物,克隆斯氏按蚊TEP1基因,用荧光定量PCR检测TEP1基因在抗疟药硝喹诱导下的变化;同时解剖各组雌蚊(各25只),光镜观察约氏疟原虫卵囊的黑化情况,分析TEP1基因与抗疟药诱导的黑化反应的关系。结果成功克隆TEP1基因,推测其氨基酸序列含有TEP分子高度保守的硫酯序列区(GCGEQ)。荧光定量PCR检测结果显示,抗疟药硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因表达上调,于诱导后第3天,A组的TEP1基因相对表达量为2.423,是B组(1.036)的2.5倍,两者差异有统计学意义(P卵囊出现黑化现象,黑化率约14.0%,而B组则未发现有黑化现象。结论抗疟药物硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因上调,该基因与约氏疟原虫卵囊黑化相关。

关键词：硝喹 TEP1基因斯氏按蚊约氏疟原虫卵囊黑化反应

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2006年第6期24卷 441-444页

作者：魏秋芬曾令娥孙宝清邵长玲王凤芸诸欣平首都医科大学燕京医学院免疫学与病原生物学教研室北京101300 首都医科大学基础医学院病原生物学教研室北京100069

目的观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。方法解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊,取中肠(胃)制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠(8只,100μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10d,末次免疫后10d,腋窝动脉取血,分离血清。... 详细信息

目的观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。方法解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊,取中肠(胃)制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠(8只,100μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10d,末次免疫后10d,腋窝动脉取血,分离血清。用蛋白质印迹(Westernblotting)分析中肠蛋白的免疫活性抗原。用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量(Mr)为38000～50000的蛋白。用该中肠蛋白免疫小鼠(12只,100μg/只),共免疫4次,每次间隔7～10d。同时设PBS对照组。末次免疫后7d,ELISA检测小鼠血清中的抗体,抗体效价≥1:2560时,该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫(约含2×107个感染疟原虫的红细胞),感染后3d取小鼠尾血镜检,雌配子体数>2/10个视野的小鼠作为供血鼠,斯氏按蚊成蚊吸血后9d解剖,计数中肠的卵囊数量。结果West-ernblotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条,其中Mr38000～50000的区带显色较清晰;实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%(62/216)和51.09%(47/92)(P卵囊指数分别为14.14(1541/109)和26.02(1223/47),两者差异有统计学意义(P卵囊的发育有明显的抑制作用。

关键词：斯氏按蚊中肠蛋白抗体卵囊约氏疟原虫抑制作用

用核酸染色和小鼠感染力方法评估脱囊和热处理后的隐孢子虫卵囊的活力(英文)

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中国兽医学报 2009年第10期29卷 1274-1277,1289页

作者：李训德阿特维尔罗伯特加州大学戴维斯分校种群健康与繁育系戴维斯美国加州95616

温度是影响隐孢子虫活力的重要环境因素之一。对于疾病暴发的风险评估需要有效的方法来准确分析卵囊的活力。本试验应用核酸染色和小鼠感染力2种方法研究了脱囊和热处理后完整卵囊和不完整卵囊的活力,并与新鲜卵囊进行了对比。结果表明... 详细信息

温度是影响隐孢子虫活力的重要环境因素之一。对于疾病暴发的风险评估需要有效的方法来准确分析卵囊的活力。本试验应用核酸染色和小鼠感染力2种方法研究了脱囊和热处理后完整卵囊和不完整卵囊的活力,并与新鲜卵囊进行了对比。结果表明,脱囊和中性温度热处理后的完整卵囊保持活力。然而,高温处理后的完整卵囊以及脱囊和热处理后的不完整卵囊完全丧失活力。对于新鲜卵囊,灭活卵囊,以及在脱囊后或在40℃和70℃处理后的完整和非完整卵囊,核酸染色法和小鼠感染力法的结果相对应;但是对于50℃和60℃处理后的完整卵囊这2种方法不对应。

关键词：隐孢子虫卵囊活力感染力