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宫颈癌组织IEX-1表达及其与HPV感染相关性研究

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中华肿瘤防治杂志 2017年第2期24卷 93-97页

作者：张庆庆韩丽萍余海洋刘丽雅李元郑州大学第一附属医院妇科.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室河南郑州450052

目的即刻早期反应基因(immediate early response gene X-1,IEX-1)是一种凋亡易感基因,在多种人类恶性肿瘤中表达失调,但在宫颈癌组织中的表达相关研究较少,检测宫颈癌组织IEX-1的表达,了解其在宫颈癌发生发展中的作用,分析其与人乳头... 详细信息

目的即刻早期反应基因(immediate early response gene X-1,IEX-1)是一种凋亡易感基因,在多种人类恶性肿瘤中表达失调,但在宫颈癌组织中的表达相关研究较少,检测宫颈癌组织IEX-1的表达,了解其在宫颈癌发生发展中的作用,分析其与人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染的关系。方法收集2011-01-01-2015-10-31郑州大学第一附属医院病理科存档蜡块标本132份,采用免疫组化法检测IEX-1在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及良性宫颈病变组织中的表达情况,分析IEX-1的表达与宫颈癌临床病理关系。采用RT-qPCR法及蛋白质印迹法检测Siha(HPV16+)、HeLa(HPV18+)和C-33a(HPV-)3种宫颈癌细胞株中IEX-1mRNA及蛋白的表达,siRNA法靶向沉默E6后Siha细胞E6、IEX-1的mRNA及蛋白表达,分析与HPV感染的关系。结果 IEX-1在宫颈良性病变、CIN组织和宫颈癌组织中的表达分别为72.4%、58.7%和21.1%,差异有统计学意义,χ~2=21.345,P=0.001。宫颈癌组织IEX-1的表达与患者年龄、病理类型、HPV感染型别及FIGO分期无关,均P>0.05。IEX-1的表达与宫颈癌分化程度、淋巴结转移情况及宫旁浸润密切相关,均P<0.05。C-33a细胞中IEX-1mRNA表达量为21.652±9.020,明显高于Siha细胞的1(t=7.34,P<0.001)和HeLa细胞的1.742±0.854(t=6.21,P<0.001);IEX-1蛋白表达量为18.017±1.351,明显高于Siha细胞的1.519±0.391(t=8.16,P<0.001)和HeLa细胞的1.957±0.363(t=7.19,P<0.001)。干扰组E6mRNA水平为0.218±0.106,低于阴性对照组的1.031±0.072(t=9.21,P<0.001)和空白对照组(t=8.46,P<0.001);干扰组E6蛋白表达量为0.184±0.274,低于阴性对照组的0.692±0.133(t=8.71,P<0.001)和空白对照组的0.783±0.097(t=8.06,P<0.001)。干扰组IEX-1mRNA水平为20.083±0.672,低于阴性对照组的1.193±0.408(t=9.04,P<0.001)和空白对照组,t=7.56,P<0.001;干扰组IEX-1蛋白表达量为0.672±0.135,低于阴性对照组的0.137±0.071(t=7.92,P<0.001)和空白对照组的0.081±0.009(t=6.47,P<0.001)。结论IEX-1在宫颈癌中表达降低,其表达水平与宫颈癌恶性程度呈负相关,可能参与了宫颈癌的发生与发展。IEX-1在宫颈癌细胞中的表达与HPV感染有关,但与感染的HPV型别无关。

关键词：宫颈癌即刻早期反应基因-1 人乳头瘤病毒宫颈上皮内瘤变

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

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中国妇幼保健 2013年第14期28卷 2297-2299页

作者：韩丽萍张晓雪张毅耿丽娜李萌萌郑州大学第一附属医院妇产科河南郑州450052 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染... 详细信息

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染前后IEX-1mRNA和蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。结果:成功转染IEX-1基因后可检测到IEX-1mRNA的高表达;转染组细胞的增殖速度增快(P<0.05),但对顺铂的敏感性明显增强(P<0.05)。结论:IEX-1可增强卵巢癌细胞的体外增殖能力,并增强卵巢癌细胞体外对顺铂化疗的敏感性,为肿瘤的有效干预和治疗提供新的靶点。

关键词：即刻早期反应基因-1 SKOV3 基因重组顺铂转染

IEX-1的UVB诱导性及其与HIF-1α、NF-κB在宫颈癌组织中表达的相关性

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IEX-1的UVB诱导性及其与HIF-1α、NF-κB在宫颈癌组织中表达的相...

作者：郭书焕郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的子宫颈癌是妇科三大常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。随着对肿瘤的发生、发展机制的不断深入，基因治疗成为继手术、放疗、化疗等传统治疗方式后的新的治疗手段。肿瘤基因-放射治疗也成为肿瘤治疗研究的新热点。即... 详细信息

背景和目的子宫颈癌是妇科三大常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。随着对肿瘤的发生、发展机制的不断深入，基因治疗成为继手术、放疗、化疗等传统治疗方式后的新的治疗手段。肿瘤基因-放射治疗也成为肿瘤治疗研究的新热点。即刻早期反应基因-1(Immediate Early Response Gene X-1，IEX-1),属于即刻早期基因（IEG）家族之一，定位于人6号染色体短臂(6p21.3)，是一种能在生长因子、紫外线、电离辐射及缺血缺氧等诱导下快速表达,调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡等各方面的基因。IEX-1的在不同组织中的过表达可正性或负性影响细胞的生存和细胞进程。有研究表明IEX-1mRNA的表达在受到紫外线照射之后显著增加，具有时间和剂量依赖性。IEX-1的UVB诱导性使得其成为肿瘤基因治疗的靶点具有可能性,也为其带来了潜在的临床应用性。研究证实IEX-1在多种肿瘤组织中低表达或表达消失;但其在宫颈癌组织中的表达情况尚罕有报道。本研究采用紫外线照射方法照射宫颈癌HeLa细胞，分析宫颈癌细胞中IEX-1基因的辐射可诱导性，同时应用免疫组化的方法从蛋白水平分别检测IEX-1、HIF-1α、NF-κB在宫颈癌组织,宫颈CIN组织及正常宫颈组织的表达情况及三者间的关系，进一步探讨IEX-1与宫颈癌发生发展的联系，为其作为临床治疗宫颈癌的靶点基因提供依据。方法1．采用不同剂量紫外线照射人宫颈癌HeLa细胞，RT-PCR检测照射后细胞IEX-1mRNA的表达情况，选出最佳紫外线剂量。2．以最佳紫外线照射剂量照射人宫颈癌HeLa细胞，RT-PCR检测照射后不同时间点细胞中IEX-1mRNA的表达情况。3．应用免疫组织化学SP法检测50例宫颈癌患者、40例CIN及26例正常宫颈组织中IEX-1、HIF-1α、NF-κB蛋白的表达情况，并分析三者之间的关系。4．应用SPSS16.0进行统计学分析，χ2检验和Spearman等级相关分析,检验水准α=0.05,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1．分别应用不同等剂量的UVB照射人宫颈癌HeLa细胞后，IEX-1mRNA表达量均有明显增高（P1mRNA表达增高幅度最大，为最佳紫外线照射剂量。2．以最佳紫外线剂量40mJ/cm2照射人宫颈癌HeLa细胞，培养不同时间后检测IEX-1mRNA表达的表达量，培养4小时后IEX-1mRNA表达量最高（P1在宫颈癌组织中的阳性表达率明显低于宫颈CIN和正常宫颈组织,差异具有统计学意义(P1α和NF-κB在宫颈癌组织中的阳性表达率均明显高于宫颈CIN和正常宫颈组织,差异具有统计学意义(P1、HIF-1α、 NF-κB的表达均与组织学分级及有无淋巴结转移相关(P0.05)。5．宫颈癌组织中HIF-1α和NF-κB的表达呈正相关（r=0.398,P1的表达呈负相关(r1=-0.322,P17,P1．人宫颈癌HeLa细胞中IEX-1具有辐射诱导性，可被UVB诱导表达，且具有时间和剂量依赖性。***-1在宫颈癌组织中低表达，与NF-κB、HIF-1α表达呈负相关，三者共同调节肿瘤细胞的生长和凋亡。

关键词：即刻早期反应基因-1 辐射诱导性宫颈癌 HeLa 免疫组织化学法

呼吸道合胞病毒感染对大鼠脊髓背根神经节转录因子活性的影响

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呼吸道合胞病毒感染对大鼠脊髓背根神经节转录因子活性的影响

作者：王慧中南大学

学位级别：硕士

目的:在研究RSV感染后气道神经源性炎症和气道神经可塑性致气道高反应性的基础上,研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染后大鼠脊髓背根神经节神经元转录因子的表达变化,筛选可能与气道神经可塑性相关的转录因子,进一步从细胞内信号转导和转录调... 详细信息

目的:在研究RSV感染后气道神经源性炎症和气道神经可塑性致气道高反应性的基础上,研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染后大鼠脊髓背根神经节神经元转录因子的表达变化,筛选可能与气道神经可塑性相关的转录因子,进一步从细胞内信号转导和转录调控机制深入探讨气道神经可塑性的细胞内调控机制,阐明气道神经可塑性导致气道高反应性和哮喘的机理,为哮喘的防治探索一条新的途径。方法:RSV病毒株接种于铺满单层Hela细胞的细胞培养瓶中,待病变达100%时收获病毒。-70℃保存备用。收集无病毒的Hela单层细胞培养瓶中培养基上清液和细胞溶解产物,从而获得病毒基质作为阴性对照。进行感染性(50%组织细胞发生病变的感染剂量即TCID50/0.1ML)的测定(毒力测定)。1-2周龄SD大鼠(湖南省农业大学动物部)随机区组分为2组,每组30只。1组:空白对照组:2组:RSV感染组①对照组(30只),用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,每一个鼻孔内滴入0.4u/g无病毒培养基。②RSV感染组(30只),用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,在每一个鼻孔内滴入0.4ul/g滴度为5X10～4TCID50/0.1ML的RSV病毒悬液。以上操作每周重复一次。两组第8周按编号后抽签方法将其中5只大鼠进行气道反应性测定,气道反应性测定后,取左肺,HE染色观察病理改变,行免疫组化染色检测,在冰面上迅速剖取脊髓背根神经节C7-T5于冻存管中,保存于液氮中。原位杂交法检测肺组织RSV蛋白的存在,免疫组化检测气道、神经节SYN、NF的表达,用转录因子活性芯片初步筛选调控气道神经可塑性的信号转录因子,western blot检测EGR-1在肺组织和脊髓背根节的表达变化。结果:(1)实验组大鼠渐出现卡他性鼻炎、呼吸气促、毛乱、活动度降低的临床表现,实验组大鼠与对照组大鼠在平均体重差异无显著性,体温差异有显著性(P＜0.05)。(2)实验组大鼠吸入梯度浓度组胺后气道阻力明显高于正常对照组,差异有显著性(均P＜0.05),说明存在气道高反应性。(3)光镜下实验组大鼠肺组织符合典型间质性肺炎的病理改变。(4)实验组气道壁、神经节中SYN、NF蛋白表达平均阳性系数显著高于对照组(P＜0.05)。(5)利用TranSignal蛋白/DNA组合芯片(345)检测筛选:RSV反复感染引起大鼠C7-T5背根节345个转录因子中的55个表达上调2倍以上,43个表达下调2倍以上。(6)western blot检测EGR-1在肺部和脊髓背根节细胞的表达变化,结果显示EGR-1在RSV感染组表达明显低于对照。结论:(1)采用RSV滴鼻的方式建立SD大鼠气道高反应性模型,能成功复制出气道高反应性大鼠模型。(2)反复呼吸道合胞病毒感染引起幼鼠气道神经网络发育异常改变(神经可塑性改变)。(3)转录因子活性芯片初步筛选出了反复呼吸道合胞病毒感染后脊髓背根节神经元细胞内发生活性改变的转录因子98种,为进一步探索反复呼吸道合胞病毒感染后气道神经可塑性变化的关键转录因子提供了研究基础。

关键词：呼吸道合胞病毒气道神经可塑性转录因子即刻早期反应基因-1

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

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IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

作者：耿莉娜郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的卵巢癌由于早期缺乏典型临床表现,具有病程短,易早期转移等特点,大部分卵巢癌被确诊时已是晚期,目前虽应用手术、化疗、放疗及生物治疗等综合治疗方法,5年生存率已有所提高,但其死亡率仍在妇科恶性肿瘤中最高。因此寻找... 详细信息

背景和目的卵巢癌由于早期缺乏典型临床表现,具有病程短,易早期转移等特点,大部分卵巢癌被确诊时已是晚期,目前虽应用手术、化疗、放疗及生物治疗等综合治疗方法,5年生存率已有所提高,但其死亡率仍在妇科恶性肿瘤中最高。因此寻找有效的抑制卵巢癌发生发展的治疗靶点成为目前研究的热点,基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌的治疗提供了新的思路。即刻早期反应基因-1（immediate early response gene X-1,IEX-1）属即刻早期基因家族,定位于人染色体6p21.3,与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）位点毗邻。近年研究表明,IEX-1在多种恶性肿瘤中表达异常,外源性IEX-1导入有调控肿瘤细胞生长和恶性转化的作用,提示IEX-1与肿瘤的发生发展可能存在着某种关系。最新研究表明,IEX-1在卵巢良性和交界性肿瘤组织内均有所表达,而卵巢癌组织中IEX-1表达强度减弱且阳性例数减少;且在卵巢上皮性肿瘤中IEX-1的表达和凋亡指数二者呈正相关,提示IEX-1的低表达与卵巢癌的恶性行为有关。本研究采用脂质体介导的基因转染技术,将重组质粒pEGFP-N1-IEX-1转染低表达IEX-1的人卵巢癌细胞SKOV3,观察IEX-1对卵巢癌细胞增殖、细胞周期以及顺铂敏感性的影响,进一步探讨其在卵巢癌发生发展中的作用,及其作为卵巢癌基因治疗靶点的意义,为临床治疗卵巢癌提供有价值的依据。方法 1.提纯重组质粒pEGFP-N1-IEX-1, PCR鉴定质粒的正确性。采用脂质体介导将重组质粒pEGFP-N1-IEX-1和空质粒pEGFP-N1分别转染人卵巢癌细胞SKOV3;实验分三组：SKOV3组、SKOV3-EGFP组和SKOV3-IEX-1组。通过荧光倒置显微镜观察转染效率;采用RT-PCR及免疫细胞化学方法检测转染前后三组细胞中IEX-1mRNA和蛋白的表达情况。 2.采用流式细胞仪观察转染前后卵巢癌细胞SKOV3细胞周期的变化,分析IEX-1对SKOV3细胞周期的影响。 3.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。 4.应用SPSS17.O软件进行统计学分析,计量资料多组间均数差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及bonferroni法检验。以双侧α=0.05为检验水准。结果 ***扩增重组质粒pEGFP-N1-IEX-1长度约412bp,证明插入序列正确。在SKOV3细胞中可见IEX-1mRNA和蛋白低表达,转染IEX-1后可检测到IEX-1mRNA和蛋白的高表达。 2.重组质粒pEGFP-N1-IEX-1转染SKOV3细胞后,24h后荧光倒置显微镜下可见大量绿色荧光颗粒。 3.流式细胞仪检测细胞周期结果显示：SKOV3-IEX-1组、SKOV3-EGFP组和SKOV3组细胞的细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为：（62.93±1.27）%、（32.30±1.20）%、（4.41±0.97）%;（75.16±1.32）%、（17.98±1.05）、（6.82±0.27）%;（75.34±0.43）%、（16.89±0.29）%、（7.17±0.18）%;三组之间差异分别具有统计学意义。SKOV3-IEX-1组细胞与其他两组相比增殖期（S期+G2/M期）细胞比例显著增加,G0/G1期显著降低。 ***检测细胞增殖结果显示：转染重组质粒pEGFP-N1-IEX-1细胞的增殖速度较未转染细胞及转染空载体的细胞明显增快,差异有统计学意义（P＜0.05）;而转染空载体组与正常细胞组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。 5.转染pEGFP-N1-IEX-1的SKOV3细胞对顺铂的敏感性增强,与转染空载体的SKOV3细胞和未转染的SKOV3细胞相比,差异有显著性（P＜0.05）,而其余两组间比较则无显著性差异（P＞0.05）。结论 ***-1可通过细胞周期中G1/S检验点起促进作用,从而增强卵巢癌细胞的体外增殖能力。 ***-1可增强卵巢癌细胞体外对顺铂的敏感性。 3.在卵巢癌细胞系SKOV3中,通过调节细胞周期,过表达的IEX-1在细胞良好的生长条件下促进细胞增殖;而在细胞不良的生长条件下,促进细胞凋亡

关键词：即刻早期反应基因-1 SKOV3 顺铂转染逆转录聚合酶链锁反应

IEX-1在宫颈癌中的表达及其与HPV感染的相关性

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IEX-1在宫颈癌中的表达及其与HPV感染的相关性

作者：余海洋郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全球范围内宫颈癌发病率在女性癌症中占第三,仅次于肺癌和胃癌,约有90%的宫颈癌死亡病例发生在发展中国,严重威胁着女性生命健康。宫颈癌最主要的两种类型是鳞状细胞癌(squamous ... 详细信息

背景和目的子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全球范围内宫颈癌发病率在女性癌症中占第三,仅次于肺癌和胃癌,约有90%的宫颈癌死亡病例发生在发展中国,严重威胁着女性生命健康。宫颈癌最主要的两种类型是鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,ADCA),宫颈鳞癌约占80%左右,近年来宫颈腺癌的发病率不断增加。持续的高危型人乳头瘤病毒(high risk human papilloma virus,HR-HPV)感染是宫颈癌最主要的致癌因子,其中HPV16和HPV18是最常见的HR-HPV型别。早期蛋白E6和E7是HR-HPV的主要癌蛋白,E6可泛素化水解P53,导致P53依赖的细胞凋亡和/或衰老的损失,而E7结合p RB从而导致细胞周期紊乱。因此,HR-HPV感染可导致细胞的恶性转化和肿瘤的发展。1993年Charles等在小鼠成纤维细胞中发现了即刻早期反应基因(Immediate early response gene X-1,IEX-1),作为即刻早期基因(immediate early gene,IEG)一员,IEX-1可以在多种刺激条件下短暂快速地表达。这些刺激因子包括生长因子、细胞因子、电离辐射、病毒感染和其他类型的细胞应激因素。IEX-1参与细胞的代谢、增殖、凋亡、分化及细胞周期调节等多种生物学效应。IEX-1在调节细胞周期和凋亡过程中发挥着复杂的作用。虽然目前研究已经证实在多种人类恶性肿瘤中IEX-1表达失调,但在宫颈癌中IEX-1的研究较少,IEX-1在宫颈癌中的表达情况如何,IEX-1表达与宫颈HPV感染是否相关尚不清楚。本研究将通过免疫组化法分析IEX-1在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)组织及正常宫颈组织中的表达情况,分析IEX-1的表达与宫颈癌临床病理关系,预测IEX-1在宫颈癌发生发展中的作用。并通过实时荧光定量PRC(RT-q PCR)法及Western Blot法分析不同HPV感染状态的宫颈癌细胞中IEX-1的表达差异。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象。RNAi法具有高度的序列专一性,通过瞬时转染si RNA导入细胞可以特异地使特定基因沉默。我们通过设计针对HPV16 E6的si RNA,转染Si Ha细胞,特异性沉默Si Ha细胞中E6的表达,检测沉默E6前后Si Ha细胞中IEX-1的表达,以探索IEX-1的表达与HPV感染的相关性及其可能涉及的机制。本课题将为明确宫颈癌变过程中IEX-1的作用及研究其与HPV的相互作用提供理论依据。材料与方法1.人宫颈癌细胞株Si Ha(HPV16+)、He La(HPV18+)、C-33a(HPV-)均由华中科技大学惠赠。收集2010年1月到2014年10月在郑州大学第一附属医院病理科存档蜡块标本132份(其中手术标本124例,活检标本8例)。其中正常宫颈29例,年龄32-61岁;CIN 46例(Ⅰ级19例、Ⅱ级17例、Ⅲ级10例),年龄29-58岁;宫颈癌57例(鳞癌35例、腺癌22例),年龄27-65岁。宫颈癌根据FIGO临床病例分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期26例,Ⅲ期6例,Ⅳ期2例。分化等级:高分化13例,中分化18例,低分化26例。2.免疫组化SP法检测IEX-1在正常宫颈组织、CIN组织及宫颈癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征的关系。3.以RT-q PCR法检测Si Ha、He La、C-33a宫颈癌细胞系中IEX-1表达,Western Blot法检测Si Ha、He La、C-33a宫颈癌细胞系中IEX-1蛋白质表达。***-q PCR和Western Blot法检测E6特异性si RNA干扰Si Ha细胞前后Si Ha细胞中E6及IEX-1的m RNA及蛋白表达水平。5.统计学处理:采用SPSS17.0软件统计分析,定性资料比较采用卡方检验,定量资料比较采用单因素方差分析,以P0.05)。IEX-1的表达与宫颈癌分化程度及肌层浸润深度相关。分化程度越低,IEX-1蛋白阳性表达率越低(c2=6.642,P=0.009<0

关键词：宫颈癌即刻早期反应基因-1 HPV RNAi