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食品与发酵工业 2022年第13期48卷 16-24页

作者：名晓东郭自涛陈剑雄顾正华辛瑜孙海彦关彦明张梁江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101 中国食品发酵工业研究院有限公司北京100015

对产卤代烷脱卤酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA进行发酵优化以提高其表达量。该研究从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验在摇瓶水平上对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵的工艺条件进行优化;最后,... 详细信息

对产卤代烷脱卤酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA进行发酵优化以提高其表达量。该研究从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验在摇瓶水平上对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵的工艺条件进行优化;最后,在5 L发酵罐中进行了初步放大验证。结果表明,最优的培养基组成为:甘油10 g/L,酵母粉23 g/L,蛋白胨14 g/L,MgSO_( 4)·7H_(2)O 1.3 g/L,ZnSO_( 4)·7H_(2)O 0.1 g/L,酶活力可达到(1182.94±10.86)U/L,较初始培养基提高了94%;最优的发酵工艺条件为:接种量5%,装液量40 mL/250 mL,37℃培养至OD_(600)为1.8时加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于20℃诱导22 h,酶活力可达到(3585.83±15.02)U/L,提高至未进行优化前的5.87倍;5 L发酵罐初步放大验证实验中,酶活力最高达到(9682.62±191.16)U/L,提高至摇瓶水平的2.7倍。通过在摇瓶水平对发酵培养基与工艺进行优化,以及在5 L发酵罐中进行放大验证,极大地提高了卤代烷脱卤酶的酶活力,为放大生产奠定了基础。

关键词：卤代烷脱卤酶大肠杆菌发酵优化响应面法

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卤代烷脱卤酶的发酵工艺优化及固定化

卤代烷脱卤酶的发酵工艺优化及固定化

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作者：名晓东江南大学

学位级别：硕士

工农业生产过程中产生大量的卤代化合物对人类健康以及生态环境有着巨大的危害。利用卤代烷脱卤酶降解这类化合物具有温和、环保、无毒、无腐蚀的特点,逐渐成为治理环境污染物的研究热点,其广泛的应用目前主要受限于酶的稳定性与产量方... 详细信息

工农业生产过程中产生大量的卤代化合物对人类健康以及生态环境有着巨大的危害。利用卤代烷脱卤酶降解这类化合物具有温和、环保、无毒、无腐蚀的特点,逐渐成为治理环境污染物的研究热点,其广泛的应用目前主要受限于酶的稳定性与产量方面。为了提高卤代烷脱卤酶(Dha A)的产量并提高其稳定性,本研究在摇瓶水平与5 L发酵罐水平进行了发酵条件的优化,并对酶进行了固定化研究。主要研究内容和结果如下:(1)在摇瓶水平上进行发酵条件的优化,首先,从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵条件进行优化。结果表明:最优的培养基组成为:甘油10 g·L,酵母粉23 g·L,蛋白胨14g·L,Mg SO·7HO 1.3 g·L,Zn SO·7HO 0.1 g·L,酶活力可达到1182.94 U·L,较初始培养基的酶活力提高了94%;最优的发酵条件为:装液量40 m L/250 m L,接种量5%,37℃培养至OD为1.8时加入终浓度为0.4 mmol·L的IPTG于20℃条件下诱导22h,酶活力可达到3585.83 U·L,提高至摇瓶最初条件的5.87倍。(2)在5 L发酵罐水平上进行发酵条件的优化,首先,在分批发酵实验中对初始碳源浓度、诱导温度、诱导p H进行了优化;其次,在补料分批发酵中对添加诱导剂时间、诱导时期的补料策略、诱导剂浓度进行了优化;最后,在最优发酵工艺基础上进行了蛋白产量的验证。结果表明:分批发酵最优工艺为:初始碳源浓度20 g·L、诱导温度25℃、诱导p H 7.0为最佳的发酵条件,酶活力可达到8905.95 U·L,提高至摇瓶水平的2.48倍;补料分批发酵的结果表明:菌体浓度(OD)达到45时降温至25℃并添加终浓度为0.4 mmol·L的IPTG进行诱导,然后以0.15 h的比生长速率进行指数补料,当补料速率达到20 m L·h时,以此速率进行恒速补料至发酵结束为最佳发酵条件,酶活力可达到35360.00 U·L提高至分批发酵的3.97倍,实现了大肠杆菌的高细胞密度发酵。蛋白产量的验证的结果表明:菌体湿重可达212.33 g·L,菌体干重可达51.40 g·L,粗蛋白浓度可达30.67 g·L,纯化后的蛋白浓度可达11.93 g·L。(3)对卤代烷脱卤酶进行了金属杂化纳米花固定化,首先,对固定化的条件进行了优化;然后,利用SEM、FT-IR与XRD对固定化酶的形貌、官能团以及结晶情况进行了表征;最后,对游离酶与固定化酶的酶学性质进行了测定。结果表明最佳的固定化条件为:终浓度2.4 mmol·L的Fe、20 mmol·L的磷酸盐、0.07 mg·m L的蛋白浓度、p H为8.0的条件下固定化60 h,固定化后的酶活回收率可达138.54%。相对于游离酶,固定化酶的最适温度与最适p H没有发生变化,但在整个温度与p H梯度内,固定化酶均表现出比游离酶更好的活性,同时固定化酶的p H稳定性与储存稳定性均得到了一定的提高,重复使用6次后仍然保留40%以上的酶活。

关键词：重组大肠杆菌卤代烷脱卤酶发酵优化固定化响应面法

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