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南方水稻黑条矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒的应用性能验证

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中国植保导刊 2018年第7期38卷 34-39页

作者：王亚琴姜军黄德青周雪平洪健吴建祥浙江大学生物技术研究所/水稻生物学国家重点实验室浙江杭州310058 开封市祥符区农业科学研究所河南开封475100

以制备的抗南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)单抗2C2为核心,建立了检测水稻叶片和白背飞虱虫中SRBSDV的dot-ELISA试剂盒。试剂盒的灵敏度分析表明,当SRBSDV感染病叶稀释到1∶10 240倍(w/v,g/m L... 详细信息

以制备的抗南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)单抗2C2为核心,建立了检测水稻叶片和白背飞虱虫中SRBSDV的dot-ELISA试剂盒。试剂盒的灵敏度分析表明,当SRBSDV感染病叶稀释到1∶10 240倍(w/v,g/m L)、单头携毒白背飞虱稀释到1∶51 200倍(头/μL)时仍能检测到SRBSDV。建立的试剂盒检测感染SRBSDV的水稻和携毒白背飞虱呈阳性反应,而检测感染水稻黑条矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻瘤矮病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻锯齿矮缩病毒的病叶和健康水稻及非携毒白背飞虱呈阴性反应。试剂盒的田间样品检测结果与RT-PCR方法的检测结果的符合率达到100%,核酸测序和序列比对结果发现RT-PCR检测阳性的样品确实感染SRBSDV。试验结果表明,建立的检测试剂盒能准确、有效地检测田间白背飞虱及水稻样品中的SRBSDV,可为我国南方水稻黑条矮缩病的检测和诊断、预测预警及科学防控提供技术服务。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体 dot-ELISA 白背飞虱

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

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植物保护学报 2017年第3期44卷 467-472页

作者：江彤何志龙张享享夏伟伟李祥宇安徽农业大学植物保护学院合肥230036

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克... 详细信息

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni^(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒 S7片段克隆 S7-1基因原核表达

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表达

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华南农业大学学报 2017年第1期38卷 58-62页

作者：江彤单文书夏伟伟张享享蒋西子安徽农业大学植物保护学院安徽合肥230036

【目的】探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)安徽分离物(SRBSDVAn Hui-HN2)的遗传特性,并获得原核表达的P5-2蛋白。【方法】RT-PCR扩增SRBSDV S5片段,克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插... 详细信息

【目的】探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)安徽分离物(SRBSDVAn Hui-HN2)的遗传特性,并获得原核表达的P5-2蛋白。【方法】RT-PCR扩增SRBSDV S5片段,克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插入原核表达载体,重组载体转化大肠埃希菌并用IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表达情况。【结果】SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段全长3 167 bp,包含S5-2基因全长612 bp,编码204个氨基酸。序列比对结果显示,SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段与其他SRBSDV分离物S5片段的序列相似性极高,达99.0%~99.7%,而与斐济病毒属(Fijivirus)其他成员S5片段的序列相似性较低,仅为38.0%~71.3%;构建的S5片段系统发育树表明SRBSDV和RBSDV聚成1个分支,其中6个SRBSDV分离物聚成1个亚分支。原核表达获得相对分子质量约为47 000的重组蛋白,Western blot分析显示,GST单抗能够与重组融合蛋白发生特异性反应。【结论】SRBSDV各分离物之间亲缘关系非常近,而与Fijivirus其他成员亲缘关系较远,原核表达获得的融合蛋白为靶标蛋白。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒 S5片段 S5-2基因原核表达

南方水稻黑条矮缩病毒P6的体外表达及其与抗病毒化合物的相互作用研究

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南方水稻黑条矮缩病毒P6的体外表达及其与抗病毒化合物的相互作用...

作者：王冬梅贵州大学

学位级别：硕士

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科,斐济病毒属病毒。SRBSDV形态为球状,共含有10条RNA基因,其中S6编码的非结构蛋白P6被预测为沉默抑制子。病毒的沉默抑制子蛋白在病毒侵染循环过... 详细信息

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科,斐济病毒属病毒。SRBSDV形态为球状,共含有10条RNA基因,其中S6编码的非结构蛋白P6被预测为沉默抑制子。病毒的沉默抑制子蛋白在病毒侵染循环过程起着重要作用,病毒沉默抑制子蛋白被广泛用作筛选寄主互作因子的诱饵。在田间,毒氟磷是一种对南方水稻黑条矮缩病防治效果比较好的药剂之一,在一定程度上控制南方水稻黑条矮缩病毒病的大面积暴发。本研究通过分子克隆和蛋白纯化的方法研究了P6蛋白在体外表达纯化,采用等温滴定量热法和微量热涌动法研究了抗病毒剂毒氟磷与SRBSDV P6蛋白的相互作用。在体外,通过农杆菌介导的方法研究了毒氟磷对SRBSDV P6蛋白在本氏烟草中表达的影响,在体内研究了毒氟磷对SRBSDV P6蛋白在水稻体内表达的影响。实验结果表明:通过对SRBSDV P6蛋白的体外表达成功纯化得到了纯度较高的SRBSDV P6蛋白,利用MST和ITC技术初步研究了毒氟磷与P6有强相互作用,通过活体验证发现随着毒氟磷喷施浓度的提高,SRBSDV P6蛋白的表达量逐渐降低,揭示了毒氟磷的作用机制为通过抑制P6蛋白的表达来控制南方水稻黑条矮缩病毒的致病性。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒 P6 表达纯化毒氟磷农杆菌介导

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白P6是病毒复制的关键因子

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南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白P6是病毒复制的关键因子

作者：韩玉福建农林大学

学位级别：硕士

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）由介体白背飞虱传播,不经卵传播。SRBSDV编码的非结构蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒复制和装配的场所—病毒原质（viroplasm）的组分。这三种非结构蛋白在病毒的... 详细信息

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）由介体白背飞虱传播,不经卵传播。SRBSDV编码的非结构蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒复制和装配的场所—病毒原质（viroplasm）的组分。这三种非结构蛋白在病毒的复制过程中扮演着至关重要的作用。已知P6能分别与P5-1和P9-1互作,而P5-1和P9-1不能互作,那么这三种非结构蛋白在病毒原质的形成过程中是否由某一个蛋白起着决定性的作用,需要我们深入的研究。本实验首先通过免疫荧光标记技术在介体白背飞虱培养细胞中观察SRBSDV侵染后P5-1、P6和P9-1表达的先后顺序,结果发现当SRBSDV侵染18 h时,P9-1没有表达,P6的表达量稍多于P5-1,且以颗粒状形态分布在细胞质周围;36 h时,P5-1和P6都大量表达,而此时P9-1也开始少量表达;随着侵染时间的延长,P5-1,P6和P9-1的表达量都显著升高;72h时,三种非结构蛋白均匀分布在细胞质中。所以这三种蛋白表达的先后顺序为P6,P5-1和P9-1。其次,利用RNAi（RNAinterference）干扰和免疫荧光标记技术研究发现,分别干扰P5-1、P6和P9-1在白背飞虱培养细胞中的表达,均导致SRBSDV的侵染率显著降低。同时,抑制P5-1表达后,P5-1和P9-1的表达量明显降低,但是P6的表达量和对照组相当;抑制P6表达后,P5-1、P6和P9-1的表达量都显著降低;抑制P9-1表达后,除了自身蛋白的表达量降低外,另外两个蛋白的表达水平不受影响。dsRNAs降低了目标蛋白的转录和表达水平,并且干扰P6的表达对病毒复制的影响最大。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot的实验结果也进一步证实了这一结论。最后,我们构建目的基因N端融合e-GFP或mCherry的重组杆状病毒表达载体,当SRBSDV P5-1-eGFP、P6-mCherry和P9-1-mCherry在Sf9细胞中单独表达时,P5-1-eGFP弥散分布在细胞质周围,P6-mCherry和P9-1-mCherry都以颗粒状分布在细胞质内。当三种蛋白两两组合共同侵染时,P6-mCherry与P5-1-eGFP和P9-1-eGFP都会共定位,形成颗粒状的病毒原质,而这和实验室构建的杆状病毒表达载体Bacmid-SRBSDV-P5-1、P6和P9-1侵染Sf9细胞的结果是一致的。这一结果也进一步说明P6在SRBSDV病毒原质的形成过程中起到了其他蛋白无法代替的作用。综合以上结果,本实验在细胞水平,通过观察三种非结构蛋白在介体细胞中的表达顺序,明确当SRBSDV侵染介体白背飞虱细胞后,P6最早表达,可能起重要的调控作用。借助于dsRNA诱导的RNAi、RT-qPCR和Western blot等技术手段证实了 P6是病毒复制增殖过程中最关键的因子,启动病毒原质的形成,P6能够招募P5-1和P9-1 一起形成病毒原质,P5-1和P9-1在病毒原质中参与病毒基因组的复制和病毒粒体的装配。因此,通过对P6的深入研究,有助于我们利用靶标基因找到防治水稻病毒病的方法,为生物防治提供思路。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒关键因子病毒原质介体培养细胞

南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒的单抗制备及其检测应用

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植物病理学报 2013年第1期43卷 27-34页

作者：刘欢倪跃群饶黎霞吴建祥周雪平浙江大学生物技术研究所杭州310058

用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)衣壳蛋白的C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒(Rice ... 详细信息

用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)衣壳蛋白的C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株3F1、5G1。3F1、5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,抗体类型及亚类均为IgG1,kappa链。Western blot分析表明,2株单克隆抗体均与SRBSDV和RBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用单克隆抗体3F1建立的dot-ELISA检测方法能准确、特异、灵敏地检测田间稻飞虱及水稻样品中的SRBSDV和RBSDV。SRBSDV和RBSDV单克隆抗体的制备及检测方法的建立为水稻黑条矮缩病的诊断、预测预报及科学防控提供了技术支撑。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒水稻黑条矮缩病毒多肽单克隆抗体 dot—ELISA

南方水稻黑条矮缩病毒增强水稻对传毒介体引诱能力的机理

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南方水稻黑条矮缩病毒增强水稻对传毒介体引诱能力的机理

作者：赵娅玲华南农业大学

学位级别：硕士

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）,由迁飞性害虫白背飞虱以持久增殖型方式传播,是近十年影响我国南部水稻生产的最主要病毒病害。本实... 详细信息

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）,由迁飞性害虫白背飞虱以持久增殖型方式传播,是近十年影响我国南部水稻生产的最主要病毒病害。本实验室前期研究发现SRBSDV侵染水稻后,能增强病株对无毒白背飞虱的引诱能力,从而有利于无毒白背飞虱获毒,促进病毒的传播和扩散。针对该SRBSDV-水稻-白背飞虱三者间互作的分子机理开展研究,将为了解南方水稻黑条矮缩病的流行与成灾机制,开展对该病害更有效的科学防控提供理论基础。本研究深入解析了SRBSDV调控水稻引诱无毒白背飞虱的分子机制,取得如下研究结果:1、鉴定SRBSDV编码的P6蛋白是提高水稻对无毒介体引诱能力的效应蛋白。利用转基因过表达病毒蛋白的水稻植株,采用“Y”型管嗅觉选择装置测定无毒白背飞虱的选择偏好性,结果表明,与野生型水稻相比,表达病毒P6蛋白的水稻显著增强了对无毒白背飞虱的引诱能力,而表达病毒其他10个蛋白的转基因水稻对白背飞虱的引诱能力未发生改变。2、发现乙烯信号介导了病毒增强水稻对无毒白背飞虱的引诱能力。利用基因沉默突变体,测试了主要防御信号在感病水稻增强飞虱引诱能力中的作用,结果表明,乙烯信号关键基因沉默后,感病水稻丧失了增强飞虱引诱能力的表型,而茉莉酸信号途径关键基因沉默及水杨酸信号减弱后,感病水稻仍保持了比健株更强的飞虱引诱能力。3、发现SRBSDV侵染及病毒P6过表达具有下调水稻乙烯信号的作用。RT-qPCR检测结果表明,与健康植株相比,感病植株及病毒P6蛋白过表达转基因植株中多个乙烯信号途径的下游基因显著下调表达。气相色谱检测也表明,感病植株的乙烯释放速率显著下降。4、揭示乙烯信号负调控水稻对无毒白背飞虱的引诱能力。在外源施加乙烯途径调节剂试验中发现,抑制乙烯信号能显著提高水稻对无毒白背飞虱的引诱能力,而激活乙烯合成或直接施加乙烯会降低水稻对飞虱的引诱能力。进一步地,基因突变抑制乙烯信号也能显著提高水稻对无毒白背飞虱的引诱力,而转基因过表达增加乙烯信号同样会降低水稻对飞虱的引诱能力。5、发现SRBSDV编码的P6蛋白与水稻乙烯信号的关键转录因子OsEIL2在细胞核中发生互作。通过酵母双杂交试验发现,病毒P6蛋白可与水稻乙烯信号通路中的关键转录因子OsEIL2互作,随后采用Bi FC、GST Pull-down和Split luciferase assay等方法证实了两者之间的互作,且互作发生在细胞核中。6、证实SRBSDV编码的P6蛋白只和水稻EILs家族中的OsEIL2互作,且互作抑制水稻地上部分的乙烯响应。通过酵母双杂交试验发现在水稻乙烯信号通路的转录因子OsEILs中,仅OsEIL2可与病毒P6蛋白互作;乙烯双重反应试验显示P6转基因水稻在乙烯处理后表现出胚芽鞘不能变长的现象,而根部能正常地在乙烯作用下伸长受到抑制。这与OsEIL2作用于水稻地上部分相对应,暗示着P6蛋白与OsEIL2存在特异性互作并抑制水稻地上部分的乙烯响应。7、明确了OsEIL2介导了病毒增强水稻对无毒白背飞虱的引诱能力。利用oseil2突变体水稻,测试了OsEIL2在感病水稻增强飞虱引诱能力中的作用,结果表明,将OsEIL2突变后,感病水稻丧失了增强飞虱引诱能力的表型;此外,相比于野生型水稻,oseil2突变体水稻能够增强对飞虱的引诱能力,表明OsEIL2的功能缺失能增强对无毒白背飞虱的引诱能力。8、明确了病毒的P6蛋白与OsEIL2的亚细胞定位,且发现P6和OsEIL2互作能降低OsEIL2在细胞核内的积累。将P6和OsEIL2融合荧光蛋白后在烟草中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察发现P6定位于细胞质与细胞核中,而OsEIL2表现为细胞核定位;当P6与OsEIL2共表达时OsEIL2在细胞核的积累量显著降低,而核转运抑制剂处理能抑制这种降低。9、明确了OsEIL2自我互作结构域,且发现病毒P6蛋白能干扰OsEIL2的自我互作。通过酵母双杂交和Bi FC发现OsEIL2存在自我互作,且互作结构域为OsEIL2的C端;而P6蛋白的共表达能干扰OsEIL2的自我互作,表明P6蛋白可能通过干扰OsEIL2二聚体的形成从而抑制乙烯信号转导。综上所述,本研究通过深入解析SRBSDV调控水稻引诱无毒白背飞虱取食的分子机制,发现SRBSDV侵染水稻后,其编码的P6蛋白通过与乙烯信号通路的转录因子OsEIL2互作,干扰其二聚体的形成并减少其在细胞核的积累,抑制水稻地上部分乙烯信号转导,从而吸引无毒白背飞虱取食获毒。这些结果揭示了病毒-寄主-介体三者互作的一种全新机制,为SRBSDV成灾机理的解析和病害科学绿色防控提供了新的思路。

关键词：病毒-植物-介体三者互作南方水稻黑条矮缩病毒白背飞虱防御途径乙烯信号

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的致病性分析

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杂交水稻 2015年第3期30卷 71-75页

作者：陈梅香章松柏袁正杰张松柏吴祖建刘勇中南大学研究生院隆平分院湖南长沙410125 湖南省植物保护研究所湖南长沙410125 福建农林大学植物病毒研究所福建福州350002

利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体在本氏烟中分别和共同表达了南方水稻黑条矮缩病毒可能编码的6种非结构蛋白(Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91和Pns92),采用实时荧光定量PCR技术分析了其表达水平。结果表明,与PVX空... 详细信息

利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体在本氏烟中分别和共同表达了南方水稻黑条矮缩病毒可能编码的6种非结构蛋白(Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91和Pns92),采用实时荧光定量PCR技术分析了其表达水平。结果表明,与PVX空载体侵染的本氏烟相比,只有Pns92蛋白的表达能够表现出典型的花叶症状,6种蛋白共同表达时的症状与Pns92单独表达呈现的症状相似。推测Pns92可能与病毒的致病性有关。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白致病性

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南方水稻黑条矮缩病毒检测方法的比较

植物保护学报 2014年第3期41卷 352-359页

作者：杜琳琳王跞姣周彤兰莹范永坚周益军江苏省农业科学院植物保护研究所江苏省植物病毒病诊断检测技术中心南京210014 南京农业大学植物保护学院南京210095

为明确南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)检测方法的最佳适用范围,对其现有检测方法 Real time RT-PCR、RT-LAMP、RT-PCR的灵敏性及特异性进行了比较,并分析了依据SRBSDV单克隆抗体3F1建立的斑点... 详细信息

为明确南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)检测方法的最佳适用范围,对其现有检测方法 Real time RT-PCR、RT-LAMP、RT-PCR的灵敏性及特异性进行了比较,并分析了依据SRBSDV单克隆抗体3F1建立的斑点免疫结合印迹(dot immunobinding assay,DIBA)方法对检测植物寄主和白背飞虱Sogatella furcifera Horvth的特异性。结果表明,灵敏性以Real time RT-PCR方法最高,其次为RT-LAMP方法,而普通RT-PCR方法相对较低。这3种方法均可特异性检测SRBSDV植物寄主和白背飞虱;DIBA方法可以满足SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)植物寄主和白背飞虱大量样品的检测,但不能区分SRBSDV和RBSDV。Real time RT-PCR方法实现了短时间内对SRBSDV RNA拷贝数的相对定量;RT-LAMP方法全程恒温反应,无需热循环仪。

关键词：南方水稻黑条矮缩病毒检测方法比较