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基于单颗粒成像技术的纳米粒子与细胞相互作用的研究

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基于单颗粒成像技术的纳米粒子与细胞相互作用的研究

第十届全国化学生物学学术会议

作者：熊斌吴嘉何彦张晓兵湖南大学化学化工学院

纳米颗粒与细胞的相互作用（Nanoparticle-Cell Interaction）是近年来兴起的纳米生物学与纳米医药学的重要生物学基础。纳米探针或纳米药物的靶向性、时效性以及药理机制,都与纳米粒子与细胞的相互作用息息相关。从本质上来说,这一相... 详细信息

纳米颗粒与细胞的相互作用（Nanoparticle-Cell Interaction）是近年来兴起的纳米生物学与纳米医药学的重要生物学基础。纳米探针或纳米药物的靶向性、时效性以及药理机制,都与纳米粒子与细胞的相互作用息息相关。从本质上来说,这一相互作用是由纳米粒子表面的配体分子与细胞膜表面受体分子的识别所决定的[1]。因此,研究纳米粒子与细胞的相互作用的关键在于从配体受体识别的视角对纳米粒子与活细胞的作用过程进行实时、原位与精确的分析。在本研究中,以RGD肽链修饰的金纳米粒子为模型,我们采用单颗粒成像技术对该粒子与活细胞的作用过程进行了实时原位的考察。通过分析这一作用中的RGD肽与细胞膜表面整合素分子的识别动力学过程,解析了纳米粒子表面多个受体分子与整合素结合的过程,同时在活细胞与单分子水平上构建了获得RGD肽与整合素分子亲和常数的新方法。这一研究工作有望为在活细胞水平上纳米粒子与细胞的相互作用的研究提供重要的参考与新的手段。

关键词：单颗粒成像纳米粒子细胞相互作用配体受体作用

多光子成像用上转换纳米粒子的单颗粒研究与应用进展

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发光学报 2023年第11期44卷 2041-2056页

作者：李雅珍王喜龙田跃吴建红田彦婷田碧凝太原理工大学物理学院山西太原030024 太原理工大学材料科学与工程学院新型碳材料研究所山西太原030024

多光子成像具有零背景下可见光信号输出的优势,但传统多光子探针激发域值高、光稳定性差的问题使其在生物应用中受到限制。基于稀土上转换的无机纳米粒子可在相对较低的激发光功率密度下实现稳定的上转换发光,因而成为一种重要的多光子... 详细信息

多光子成像具有零背景下可见光信号输出的优势,但传统多光子探针激发域值高、光稳定性差的问题使其在生物应用中受到限制。基于稀土上转换的无机纳米粒子可在相对较低的激发光功率密度下实现稳定的上转换发光,因而成为一种重要的多光子探针。随着成像技术的进步,对上转换纳米粒子的研究正在从聚集体形式向单颗粒水平发展。单颗粒研究上转换发光不仅有利于排除环境因素的干扰,并且呈现出一系列与聚集体研究不尽一致的理论成果。由于单颗粒研究平台更加接近于探针生物成像的工作环境,因此在这一水平下对上转换纳米粒子进行材料优化与物理机制分析更贴近实际应用。本文从多光子发光机制与材料出发,重点围绕着单颗粒水平下上转换纳米粒子近年来的研究成果与应用进展进行了综述,最后对其未来的研究方向进行了展望。

关键词：多光子探针上转换纳米粒子单颗粒成像生物应用

功能纳米材料的制备及单颗粒分析检测与细胞成像

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功能纳米材料的制备及单颗粒分析检测与细胞成像

作者：易遵艳湖南师范大学

学位级别：硕士

癌症作为一个亟待攻克的世界性难题,早期诊断方法和新型抗癌药物的发明一直受到国内外科学家们的高度关注和重视。很多研究表明miRNA作为一种癌症指标与许多癌症有着密切的关系,因此可用于癌症的早期诊断。但其长度短,易降解,且在RNA中... 详细信息

癌症作为一个亟待攻克的世界性难题,早期诊断方法和新型抗癌药物的发明一直受到国内外科学家们的高度关注和重视。很多研究表明miRNA作为一种癌症指标与许多癌症有着密切的关系,因此可用于癌症的早期诊断。但其长度短,易降解,且在RNA中成分少的特点使得miRNA的检测面临巨大的挑战。此外,一些常用的检测方法(原位杂交、印迹法、实时-PCR等)比较耗时、灵敏度低,从而限制了它们的发展,因此找到一种简单而快速的检测方法显得尤为重要。半导体纳米颗粒由于具有超强荧光、光稳定性以及窄的发射峰等优点使其具有很好的潜力。除了癌症的早期诊断之外,抗癌药物的研发也是一种有效的治疗手段。基于以上背景,本文主要以功能化的半导体聚合物与NH2-ssDNA连接后作为探针对microRNA进行分型和定量;并将修饰后的中空金纳米球(HGNs)作为抗癌药物以达到抑制癌细胞生长的目的,为此做了以下几个工作:(1)采用共轭聚合物[(9,9-二辛基芴)-交替-共-(1,4-苯并-(2,1’,3)-噻二唑)](PFBT)与两亲性磷脂-聚乙二醇-羧基在纳米共沉淀下形成带负电荷的CPNs-COOH。通过荧光和紫外表征发现该纳米颗粒具有窄的激发峰和发射峰,适合于单颗粒追踪和细胞成像。此外,稳定性实验结果表明该纳米颗粒不易受外界环境的影响(pH,放置时间,盐浓度),证明其具有良好的稳定性。其独特的光学稳定性也在相应的显微成像实验中得到进一步验证。(2)我们将CPNs-COOH与NH2-ssDNA连接后形成的复合物作为一种荧光探针。在单分子层面上,用三种尺寸的荧光探针分别探究了在不同浓度的PBS中进行短暂杂交,选择最佳探针进行microRNAs中let-7a与let-7c的分型以及let-7a的定量分析。Matlab的分析数据表明32 nm的荧光探针最为合适。此外定量分析结果证实microRNAs的浓度与短暂杂交的粒子数成正比。(3)通过牺牲钴形成模板从而得到具有近红外特性的中空金纳米球 HGNs(Hollow Gold Nanospheres)。TEM 和 DLS 结果显示HGNs的粒径约为30 nm。紫外实验表明其吸收峰处于近红外区,可用于光热治疗。接下来,我们将狼蛛抗菌肽(Lycosin-I)这一抗癌多肽修饰于HGNs表面,以期望能够达到抑制癌细胞生长的效果。

关键词：纳米颗粒短暂杂交单颗粒成像中空纳米球

基于量子点负载金球的单颗粒电化学发光成像编码

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基于量子点负载金球的单颗粒电化学发光成像编码

中国化学会第十四届全国电分析化学学术会议

作者：车志远吴升铜汤万升丁收年东南大学化学化工学院江苏省生物药物高技术研究重点实验室

电化学发光（ECL）作为一种优异的读出方法,被应用于许多基于微珠的免疫分析中。我们首次提出将量子点负载到具有优异导电性的微米级金球上,制备了在单颗粒尺度上具有良好ECL性能的微球。由于金微球的优异导电性,克服了传统钌联吡啶负... 详细信息

电化学发光（ECL）作为一种优异的读出方法,被应用于许多基于微珠的免疫分析中。我们首次提出将量子点负载到具有优异导电性的微米级金球上,制备了在单颗粒尺度上具有良好ECL性能的微球。由于金微球的优异导电性,克服了传统钌联吡啶负载聚苯乙烯微球中三丙胺扩散距离有限导致的ECL强度减弱的问题。通过选择两种发射波长的CdSe量子点以及两种量子点负载量,实现了2*2规格的ECL编码。进一步在外层修饰抗体进行夹心免疫,可以实现对血液等复杂体系中的疾病标志物的多组分同时检测。制备的传感器具有高通量,可视化,特异性强等优点。此外,此项工作也为基于微流控芯片的高通量检测奠定了良好基础。

关键词：单颗粒成像电化学发光编码免疫传感器疾病标志物

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正电荷荧光共轭聚合物的制备及基因转染研究

正电荷荧光共轭聚合物的制备及基因转染研究

作者：郑旋芳湖南师范大学

学位级别：硕士

作为一种新的治疗手段,基因治疗由于在肿瘤和遗传病治疗方面有很好的应用前景,引起了研究人员的广泛关注。目前,寻找一种高效、低毒的基因转染载体是基因治疗面临的主要难题之一。理想的基因载体不仅能将基因导入细胞中还能维持基因原... 详细信息

作为一种新的治疗手段,基因治疗由于在肿瘤和遗传病治疗方面有很好的应用前景,引起了研究人员的广泛关注。目前,寻找一种高效、低毒的基因转染载体是基因治疗面临的主要难题之一。理想的基因载体不仅能将基因导入细胞中还能维持基因原有的功能。在过去几十年中,科学家们一直致力于寻找新型的非病毒基因传递载体。荧光共轭聚合物纳米粒子(CPNs)由于具备较大的摩尔消光系数、较高的单粒子荧光亮度及卓越的抗光漂白等优良的光学性能,在生物分析、成像、诊断和药物输送等领域有着诸多的应用。然而,目前CPNs作为基因传递载体的研究在国内外报道的并不多。本论文旨在将CPNs作为一种新型载体,用于高效的基因传递,开展了以下工作:(1)将共轭聚合物[(9,9-二辛基芴)-交替-共-(1,4-苯并-(2,1',3)-噻二唑)](PFBT)与两亲性丙二醇胺阳离子脂质体通过纳米共沉淀的方法制备了带正电荷的CPNs。通过光谱及显微镜表征我们可知CPNs具有优良的荧光性能,其荧光量子产率高达70.7±0.3%,DLS测试的结果显示其尺寸大约为3.6±0.3 nm。(2)CPNs作为一种有效的荧光纳米探针,广泛应用于细胞内成像及基因转染研究。细胞成像实验结果表明共轭聚合物纳米粒子能在活细胞内快速、高效地迁移,与多种类型的细胞共培养发现颗粒均具有100%的细胞负载效率。在质粒转染实验中,与商品化lipofectamine2000相比,带正电荷的CPNs作为基因载体时基因表达效率显著地提高了。实验结果表明CPNs有望成为一种高效的非病毒基因传递载体。(3)借助高空间分辨光学显微成像技术,探索了CPNs作为基因载体与细胞膜相互作用及在细胞内的聚集和再分布过程。实验结果显示:细胞摄取CPNs的主要途径是能量依赖的内吞作用,细胞内荧光成像结果显示共轭聚合物纳米粒子大多数分布在细胞核周围,并且在共培养36 h后在细胞核周围仍观测到CPNs的存在,这就促进了共轭聚合物纳米粒子将质粒(pDNA)释放到细胞核外围最终提高了转染效率。纳米载体在活细胞内的动力学研究,为基因治疗效率的提高提供了有价值的信息。

关键词：共轭聚合物纳米颗粒基因传递单颗粒成像活细胞成像荧光显微镜

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基于单颗粒分析技术的核酸定量检测新方法

基于单颗粒分析技术的核酸定量检测新方法

作者：范雯君湖南大学

学位级别：硕士

核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的统称,可以存储、传递和编码遗传信息。核酸的异常表达及变异与许多疾病密切相关,因而核酸可作为一种重要的生物标志物用于疾病的诊断与病理分析。然而,由于体液中核酸的浓度极低,且生物体的复... 详细信息

核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的统称,可以存储、传递和编码遗传信息。核酸的异常表达及变异与许多疾病密切相关,因而核酸可作为一种重要的生物标志物用于疾病的诊断与病理分析。然而,由于体液中核酸的浓度极低,且生物体的复杂环境给核酸检测带来干扰,使得它们的检测具有很大的挑战性。目前常用的核酸检测方法有定量聚合酶链式反应(qPCR)、核酸微阵列等技术,但qPCR存在着重复性差的缺点,而核酸微阵列则需要昂贵、复杂的荧光标记策略。因此,开发重复性好、抗干扰能力强且无需复杂标记的核酸分析方法十分必要。单颗粒分析技术能以高时空分辨率和最小扰动的方式对单个颗粒进行检测,可提供与目标分子相关的数量和动态变化等信息。因此单颗粒分析技术已广泛应用于复杂生物系统中生物分子的动态监测以及疾病相关的生物标志物的检测。基于此,本论文基于单颗粒分析技术建立了两种用于目标DNA和miRNA定量检测的分析方法。具体工作如下:在第2章中,利用金属纳米颗粒的等离子体耦合效应,结合经典的“三明治”检测方法,我们构建了基于散射强度分析的目标DNA定量检测法。由于目标DNA能够诱导捕获DNA修饰的金纳米颗粒聚集,聚集的颗粒在暗场显微镜下呈现出显著增大的散射强度,因而可以通过考察探针聚集体-单体的比值与目标物浓度之间的关系来实现目标DNA的定量检测。实验结果表明,该方法线性范围为1-750 pM,检测下限为1 pM。与其他无扩增的方法相比,该方法操作简单,灵敏度较高。该方法与滚环扩增反应(RCA)、杂交链式反应(HCR)等扩增方法结合后,有潜力实现体液中极低丰度DNA或miRNA的定量分析。在第3章中,基于自校准单颗粒示踪分析与RCA反应,我们开发了一种比率型miRNA定量分析的新方法。由于均相溶液中探针的运动行为受局部粘度和温度的影响往往表现出较大异质性,这使得单颗粒示踪技术难以用于均相溶液中目标物的定量分析。针对这一问题,我们通过引入参比探针开发了一种自校准单颗粒示踪分析技术。实验结果表明,检测探针与参比探针扩散系数的比值(D/D)不受体系粘度和温度的影响,因此利用D/D进行定量分析具有较高的可靠性和较强的抗干扰能力。基于这一方法,结合RCA反应,建立了一种比率型miRNA定量分析方法。其原理为目标序列与捕获DNA结合后从纳米探针表面脱落,促发纳米探针表面引物序列进行RCA反应,从而引起探针扩散速率下降。通过测定纳米探针-参比的D/D与目标序列浓度之间的关系来实现miRNA的定量检测。初步实验结果获得的检测线性范围为50 pM-50 nM。此外,我们初步验证了该方法对miRNA-21对应DNA序列的分析能力。因此,基于自校准单颗粒示踪的定量检测法具有重复性好、抗干扰能力强和无需标记的优点,尽管该方法检测灵敏度不够理想,但未来可以通过优化RCA反应时间、选择粒径更小的探针等方法提高检测灵敏度。

关键词：单颗粒成像单颗粒示踪金纳米颗粒等离子体成像核酸生物标志物

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纳米金颗粒分子逻辑门的构建及其分析应用

纳米金颗粒分子逻辑门的构建及其分析应用

作者：嵇海宁湖南大学

学位级别：硕士

分子逻辑器件具有尺寸小、存储量大、便于设计、反应速度快等诸多优点,是21世纪化学、生物和材料等最为重要的交叉领域之一。纳米金颗粒（AuNPs）以其独特的光学性质﹑小尺寸和表面效应以及优良的生物亲和性,在纳米器件、生物传感等领... 详细信息

分子逻辑器件具有尺寸小、存储量大、便于设计、反应速度快等诸多优点,是21世纪化学、生物和材料等最为重要的交叉领域之一。纳米金颗粒（AuNPs）以其独特的光学性质﹑小尺寸和表面效应以及优良的生物亲和性,在纳米器件、生物传感等领域显示了独特的价值。DNA分子由于具有可编程的序列特异性、丰富的构象变化及特殊的生物活性,近年来被认为是构建生物纳米器件的理想材料。本论文瞄准这一前沿领域,以AuNPs作为载体,结合距离依赖性的增强/猝灭荧光效应和DNA分子探针的特异性识别作用,开展了以下工作: 一、基于DNA“分子标尺”对纳米金颗粒距离依赖性的增强/猝灭荧光的研究以双链DNA作为“分子标尺”,在每条DNA的不同位置处修饰染料分子四甲基罗丹明（TMR）或荧光素（FAM）,考察染料分子修饰的DNA链和AuNPs修饰的DNA链杂交后荧光强度的变化,系统研究了AuNPs距离依赖性的增强/猝灭荧光。结果表明:染料分子和AuNPs相距0个碱基时,荧光猝灭效果最为明显;相距30个碱基时,荧光增强效果最为显著;相距50个碱基时,荧光强度变化不大。进一步实验发现AuNPs的荧光增强/猝灭效应与染料类型和AuNPs的尺寸相关。这可能是由于不同尺寸的AuNPs局域电磁场增强和荧光分子到纳米颗粒表面无辐射能量转移过程的竞争所致。该工作有助于进一步认识AuNPs对荧光分子的荧光增强/猝灭效应的机理,对相关分析方法的建立和纳米器件的构建具有参考价值。二、基于纳米金颗粒增强/猝灭荧光效应的多目标物检测及其逻辑门操作基于AuNPs对荧光分子距离依赖性的增强/猝灭荧光效应,将标记FAM的腺苷核酸适体（Aptamer）和分子信标（MB）分别修饰在AuNPs表面,通过目标物引起的DNA探针的构型变化,利用荧光信号“ON-OFF”和“OFF-ON”两种模式实现了腺苷和cDNA的检测,检测下限分别达到6.4μM和0.5 nM。在此基础上将腺苷Aptamer和MB同时标记到AuNPs表面,通过XOR型逻辑门的操作实现了多目标物的检测。本工作将AuNPs对荧光分子的距离依赖性作用应用到逻辑门的构建中,进一步拓展了AuNPs在逻辑门构建中应用。三、单颗粒水平XOR型逻辑门纳米器件的构建在前一部分工作的基础上,将FAM染料更换为Cy5,利用AuNPs距离依赖性的光学性能和DNA探针的构型变化构建了XOR型逻辑门。采用全内反射荧光显微镜进行了单颗粒成像,对目标物作用下单个颗粒荧光强度的变化进行了统计分析。结果表明,单颗粒水平与溶液均相结果一致,均具有XOR逻辑门响应。该逻辑门有望应用于多功能光电器件的构建,在纳米生物传感和DNA分子计算机方面有广阔的应用前景。

关键词：分析检测逻辑门纳米器件纳米金颗粒单颗粒成像

基于单分子成像技术研究纳米颗粒在液固界面上吸附/解吸附过程中的旋转动力学行为

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基于单分子成像技术研究纳米颗粒在液固界面上吸附/解吸附过程中...

中国化学会第十六届胶体与界面化学会议

作者：许东龙肇李安平肖华西吴伟林亲录中南林业科技大学中南林业科技大学稻谷及副产物深加工国家工程实验室

深入了解纳米颗粒在液固界面上的吸附和解吸附过程对纳米材料的应用具有非常重要的价值。我们开发了双偏振通道显微成像技术实时观测到了单个金纳米棒和棒状量子点在液固界面上的旋转行为,获得了史无前例的信息。单个纳米颗粒吸附在界... 详细信息

深入了解纳米颗粒在液固界面上的吸附和解吸附过程对纳米材料的应用具有非常重要的价值。我们开发了双偏振通道显微成像技术实时观测到了单个金纳米棒和棒状量子点在液固界面上的旋转行为,获得了史无前例的信息。单个纳米颗粒吸附在界面上后空间位置不发生明显改变,但是纳米颗粒仍然可以转动,在特定条件下我们捕捉到了四种旋转模式—不发生任何转动（S1）,面内转动（S2）,面外转动（S3）,高速转动（S4）。增加纳米颗粒和界面的吸附力,纳米颗粒会从溶液中被吸附到界面上,转动模式依次从S4转变为S3,然后S2,最后S1。而解吸附时纳米颗粒的转动状态则由S1逐渐变为S4状态,最后离开界面。我们的单分子旋转成像技术将会成为研究物理、化学和生物学事件的重要工具。

关键词：单颗粒成像分子旋转吸附/解吸附动态过程

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成像型多通道超高灵敏流式检测装置的研制

成像型多通道超高灵敏流式检测装置的研制

第八届全国化学生物学学术会议

作者：王硕朱少彬颜晓梅化学生物学福建省重点实验室分析科学重点实验室厦门大学化学化工学院化学生物学系

＜正＞纳米生物技术特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和肿瘤靶向成像技术等在生物医学、生化分析等领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。发展先进的单个纳米颗粒分析技术,快速、灵敏地对纳米颗粒进行多参数同时定量表征对于推动... 详细信息

＜正＞纳米生物技术特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和肿瘤靶向成像技术等在生物医学、生化分析等领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。发展先进的单个纳米颗粒分析技术,快速、灵敏地对纳米颗粒进行多参数同时定量表征对于推动纳米生物技术的发展具有重要意义。我们研制成功成像型多通道超高灵敏流式检测装置,可在单个纳米颗粒的散射和多色荧光检测的同时实现该粒子穿越

关键词：纳米生物分析超高灵敏流式检测仪单颗粒成像