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纳米孔单通道记录在金属离子检测中的应用

纳米孔单通道记录在金属离子检测中的应用

作者：杨纯长沙理工大学

学位级别：硕士

水资源是经济和社会可持续发展的重要物质基础之一。研究并发展用于水污染物检测和治理的新型技术,不仅是重大国家需求,也是前沿科学问题。在各类水污染物中,重金属离子是很大一类,由于其难以被微生物降解,且进入人体后会长期积累,因此... 详细信息

水资源是经济和社会可持续发展的重要物质基础之一。研究并发展用于水污染物检测和治理的新型技术,不仅是重大国家需求,也是前沿科学问题。在各类水污染物中,重金属离子是很大一类,由于其难以被微生物降解,且进入人体后会长期积累,因此水体中只要有微量重金属子即可产生很强的毒性效应,对人体危害极大。本论文拟采用一种新颖的检测技术——纳米孔单分子检测技术用于水污染物中重金属的高灵敏度检测研究。该技术是近二十年发展起来的一种崭新的单分子检测技术,但目前主要应用于DNA分子的测序研究,将其应用于重金属离子检测的研究报道很少。本论文基于Pb2+和Ba2+诱导富G寡核苷酸链形成G-四联体结构的原理,设计筛选出适合在纳米孔单通道记录中检测Pb2+和Ba2+的DNA探针。发展出一种简单快速,灵敏度高、特异性强并在不存在掩蔽剂时可以同时检测Pb2+和Ba2+的单分子检测方法。论文第四章,合成了对稀土金属离子有配位作用的邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙,并证明了其是潜在的可应用于纳米孔单通道记录系统检测稀土金属离子的分子探针。论文具体内容如下：一、构建适合Pb2+,Ba2+检测的纳米孔单通道记录检测系统。在TBA和PS2.M两段DNA序列的基础上,设计了4条能与Pb2+形成G-四联体的DNA探针,采用α-溶血毒素蛋白纳米孔,筛选出了效果最明显的DNA1——(A)30GTG GGTAGGGCGGGTTGG(A)30作为进一步研究检测Pb2+和Ba2+的DNA探针。选择0.5M(CH3)4NCl作为缓冲液盐,在+180mV/+200mV电压下记录电流变化,构建了适合Pb2+,Ba2+检测的纳米孔单通道记录检测系统。二、利用该检测系统,实现Pb2+和Ba2+单独存在时的定性和定量检测。采用圆二色光谱(CD)研究了DNA1与Pb2+和Ba2+的相互作用,结果表明Pb2+和Ba2+都能诱导DNA1形成G-四联体,而且Pb2+结合DNA1的能力强于Ba2+。相互作用的强弱导致DNA1、Pb2+-DNA1、Ba2+-DNA1三者穿越蛋白纳米孔的阻滞时间的不同,在事件信号的二维分布图中可看出,Pb2+-DNA1和Ba2+-DNA1比对照组多出两个位置有差异的特征信号区域。Pb2+-DNA1的解链时间长于Ba2+-DNA1,事件密度最大的区域分别出现在100ms和10-20ms处。研究了在Pb2+,Ba2+单独存在时,可能的12种干扰离子(K+、Na+、NH4+、Ca2+、Mg2+、Li+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Fe3+、Hg2+)的影响,证实了该方法有高的选择性。通过不对称盐浓度梯度实验,量化特征信号区的事件,使得Pb2+和Ba2+的检测限都降低至0.8nM。三、实现Pb2+和Ba2+的同时检测。Pb2+和Ba2+与DNA序列探针摩尔比对检测的影响研究表明:DNA1:Pb2+=1:1与DNA1:Ba2+=1:1叠加信号、DNA1:Pb2+:Ba2+=2:1:1、 DNAl:Pb2+:Ba2+=1:1:1、DNA1:Pb2+:Ba2+=1:2:2分峰面积比ABa/Apb分别为0.53、0.52、0.35、0.3;说明DNA1和金属离子的比例关系对检测有很大的影响,当DNA1量不变时,ABa/Apb的值会随着Pb2+和Ba2+的量变大而变小。通过分峰可实现Pb2+和Ba2+共存时的半定量检测。四、合成并通过1HNMR、13CNMR表征了邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙。通过元素分析、红外光谱分析对其与13种稀土金属离子(RE=La3+, Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、 Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Yb3+、Y3+)的配位作用进行了考察,证明形成的配合物组成为：RE(C13H10N3O3)(C13H11N3O3)·2H2O,结构为：一个稀土离子与两分子酰腙及两分子水配位,其中一个配体失去一个氢原子。说明该酰腙与稀土离子有相互作用,是潜在的可以应用于纳米孔单通道记录系统检测稀土金属离子的分子探针。综上所述,本论文开发的新的检测的方法可以用于痕量的Pb2+和Ba2+的检测,并对其真正意义上Pb2+和Ba2+的同时检测定量化提供依据。本论文的研究工作拓宽了纳米孔单通道记录技术的应用领域,为更多能与DNA分子结合的物质的检测方法的开发提供了新思路。

关键词：纳米孔单通道记录金属离子铅钡稀土检测

大鼠心室肌细胞单通道钙电流的记录及其电生理学特性分析

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中国医科大学学报 2013年第3期42卷 197-200页

作者：刘书源刘雅茹高青华赵美眯赵金生孙雪菲郝丽英中国医科大学药学院药物毒理教研室沈阳110001 中国医科大学生物制药研究室沈阳110001

目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到大鼠... 详细信息

目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好,呈杆状或柱状,具有清晰的横纹。记录到的L-型钙通道单通道电流,平均电流幅度为(1.13±0.01)pA,电导为19 pS,平均开放时间常数为(1.35±0.03)ms,平均关闭时间常数为(46.75±10.04)ms。此外,还记录到L-型钙通道的Run-down现象。结论本实验分离得到的大鼠心室肌细胞适用于膜片钳单通道记录模式;记录到的L-型钙通道的基本电生理学性质与文献报道相符。

关键词：大鼠心室肌细胞 L-型钙通道膜片钳技术单通道记录

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大鼠背根神经节分离细胞离子单通道记录技术

华中理工大学学报 1990年第3期18卷 115-122页

作者：周专康华光李之望周小萍华中理工大学自动控制工程系同济医科大学

本文探讨了在大鼠背根神经节(DRG)细胞上记录离子单通道电流的方法,研究了膜片钳实验的各个环节,研究了提高封接电阻的方法。研究结果表明,单通道记录的背景噪声取决于电极与细胞的封接水平。文中还讨论了实验系统的组装,电极制备和细... 详细信息

本文探讨了在大鼠背根神经节(DRG)细胞上记录离子单通道电流的方法,研究了膜片钳实验的各个环节,研究了提高封接电阻的方法。研究结果表明,单通道记录的背景噪声取决于电极与细胞的封接水平。文中还讨论了实验系统的组装,电极制备和细胞分离等技术。

关键词： DRG分离细胞膜片钳单通道记录

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生物膜离子单通道记录和钙通道研究

生理科学进展 1987年第2期 127-130页

作者：周新良张玉泉中国科学院上海脑研究所

80年代初发展起来的膜片钳方法在技术上有了新的突破。近年来,在生物学的各个领域内,国外已报道了大量的研究工作,预示对生物膜离子通道的认识将有一个新的飞跃。

关键词：钙通道慢通道钙通道电流膜片钳单通道记录全细胞记录膜电位生物电位离子通道钾通道生物膜

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生物膜噪声与单通道记录

生物化学与生物物理进展 1984年第4期11卷 9-14页

作者：蔡体导中国科学院上海生理研究所

三十年来,在神经和肌肉实验中使用电压箝方法获得了大量有关可兴奋膜工作特性的知识。膜电流记录技术有效地总和了流经很多离子单通道的离子流: I=〈g〉（Vm-E）（1）式中〈g〉=Npγ是膜电导,也就是等于离子单通道总数×离子单通道“... 详细信息

三十年来,在神经和肌肉实验中使用电压箝方法获得了大量有关可兴奋膜工作特性的知识。膜电流记录技术有效地总和了流经很多离子单通道的离子流: I=〈g〉（Vm-E）（1）式中〈g〉=Npγ是膜电导,也就是等于离子单通道总数×离子单通道“道通”概率×离子单通道电导,（Vm-E）是离子通过通道的电驱动力,其中Vm为膜电位,E为离子平衡电位。但要从这样的平均值中推论离子单通道的特性,一般来说是不可能的,所以从60年代尤其是70年代以来,很多工作者开始研究神经和肌肉的

关键词：道通概率平均膜噪声封接单通道记录

离子通道电流虚拟仿真实验在生理教学中的应用

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实验技术与管理 2018年第3期35卷 115-117页

作者：杨煜吕文伟吕若谷安钢吉林大学基础医学院吉林长春130021 吉林大学公共卫生学院吉林长春130021

利用模拟离子通道电流仿真实验教学设备替代高成本的膜片钳-离子通道测量平台,以降低实验成本,满足更多学生进行科研实验的需要。通过虚拟仿真实验,能够观察到离子通道蛋白分子的电流记录曲线,通过分析处理得到电压-电流分析曲线和通道... 详细信息

利用模拟离子通道电流仿真实验教学设备替代高成本的膜片钳-离子通道测量平台,以降低实验成本,满足更多学生进行科研实验的需要。通过虚拟仿真实验,能够观察到离子通道蛋白分子的电流记录曲线,通过分析处理得到电压-电流分析曲线和通道关闭时间统计曲线,从而帮助学生理解离子通道蛋白的开-关特性和电压依赖特性,同时培养学生在离子通道蛋白的电生理特性科研方面的实际操作能力。

关键词：离子通道单通道记录虚拟仪器膜片钳技术

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纳米孔单通道技术在氰化物检测中的应用研究

纳米孔单通道技术在氰化物检测中的应用研究

作者：吴筱原合肥工业大学

学位级别：硕士

Cu作为重金属离子,过量存在时会造成环境危害,影响人类健康;氰化物作为冶金、制革的必需品,在工业生产中得到广泛应用,氰化物也是一类神经性剧毒物质,同时会对环境造成不良影响。因此,寻找一种简单快捷的检测方法势在必行。本论文利用... 详细信息

Cu作为重金属离子,过量存在时会造成环境危害,影响人类健康;氰化物作为冶金、制革的必需品,在工业生产中得到广泛应用,氰化物也是一类神经性剧毒物质,同时会对环境造成不良影响。因此,寻找一种简单快捷的检测方法势在必行。本论文利用纳米孔单通道技术,基于Cu和DNA探针上三氮唑的相互作用,引起得DNA探针分子构象的变化,实现了铜离子的检测。由于Cu和CN之间的强络合作用,CN可将DNA上络合的Cu竞争下来,使得DNA构象恢复,从而进一步实现了CN的检测。在此基础上,本文利用该检测技术,基于三链分子信标,实现了对microRNA的定量检测和三段高度相似同源microRNA的同时检测。本文的主要研究结果如下:一、构建了适合Cu、CN检测的纳米孔单通道检测方法。(1)通过化学修饰得到相邻碱基修饰三氮唑的DNA探针分子,当Cu存在时,由于Cu和相邻碱基修饰的两个三氮唑作用,会引起DNA探针构象的变化,通过纳米孔单通道实验,发现探针络合Cu的阻滞时间明显延长约为49ms,阻滞幅值由83%增至90%。(2)通过CN和DNA-Cu-三氮唑中Cu的强络合作用,导致DNA构象恢复,其相应电流信号也随即恢复至82%,穿孔时间缩短,与未络合Cu的探针特征量相近。二、构建了基于三链DNA结构对microRNA检测的纳米孔单通道检测方法。(1)基于DNA探针和DNA编码分子形成的三链分子信标,当microRNA存在时,microRNA和DNA探针分子作用形成双链,三链结构瓦解,释放DNA编码分子,我们通过检测释放出的DNA编码分子的电流信号,对microRNA进行定量检测。(2)设计了5种三链DNA结构,筛选出最优的DNA11作为编码序列和DNA3构建三链体系。实现了对micro-155和let-7a的定量检测,确定了microRNA的检测范围:5 pM00 nM。(3)实现了对let-7a、let-7b、let-7c的选择性检测,DNA8-let 7c的全匹配序列信号频率为6.7个/min,含有一个错配碱基的信号频率明显降低,其中DNA6-let 7c为0.9个/min,含有两个错配的碱基信号频率降低的程度更大,如DNA 8-let 7a只有0.5个/min。说明该检测方法能够很好的区分单个核苷酸的差异,能够应用于肺癌疾病的前期诊断。(4)通过合成三种具有不同电流信号的DNA编码分子,实现了高度相似同源microRNA:let-7a、let-7b、let-7c同时存在时的定量检测,将同时检测结果与单独检测结果之间进行对比。let-7a、let-7b、let-7c对应同时检测信号频率为:4个/min,3.3个/min,4.3个/min,单独检测信号频率:4.1个/min,3个/min,3.6个/min。结果十分接近,说明该检测方法对应多组分复杂体系仍有较优的识别率,存在应用到实际血清样本中多组分、高通量检测的潜力。

关键词： CN- 纳米孔单通道记录检测 microRNA

纳米孔单通道技术应用于奶制品中三聚氰胺的检测研究

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纳米孔单通道技术应用于奶制品中三聚氰胺的检测研究

作者：胡婉君江苏大学

学位级别：硕士

三聚氰胺(Melamine)是一种重要的化工原料,由于其含氮量高达66%,且价格低廉,曾被一些不法商贩冒充蛋白质掺杂到乳制品中以提高氮含量。通常,摄入的大约90%三聚氰胺可由肾脏排出;但摄入量过多时,三聚氰胺与三聚氰酸结合形成无法溶解的氰... 详细信息

三聚氰胺(Melamine)是一种重要的化工原料,由于其含氮量高达66%,且价格低廉,曾被一些不法商贩冒充蛋白质掺杂到乳制品中以提高氮含量。通常,摄入的大约90%三聚氰胺可由肾脏排出;但摄入量过多时,三聚氰胺与三聚氰酸结合形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺结石,可能导致肾脏和泌尿系统的疾病,危害身体健康。因此,开发和建立三聚氰胺检测方法已成为了当前食品领域中研究的热点之一。目前,国内外已开展了HPLC、LC-MS、GC-MS、CE等和适体传感器、比色传感器、电化学生物传感器等方法检测三聚氰胺含量的研究。为进一步开发简单快速、灵敏度高、特异性强的三聚氰胺检测技术,本论文拟基于三聚氰胺与胸腺嘧啶(T)以氢键特异性结合的原理,设计和筛选出富含T的DNA探针,通过分析DNA-三聚氰胺复合物产生的阻滞电流信号,建立了纳米孔单通道记录检测三聚氰胺的方法,并将其应用于奶制品中三聚氰胺的检测,为高灵敏度和特异性地检测食品中三聚氰胺的含量提供一定的技术支持。主要研究结果如下:(1)构建了特异性检测三聚氰胺的纳米孔单通道记录检测体系。选用α-溶血毒素蛋白纳米孔,从设计的6条DNA探针中筛选出了与三聚氰胺特异性结合的DNA1——(C)30(T)20;在优选的温度27℃、时间1 h和添加buffer(0.1 M PB,0.3 M NaCl)等条件下,三聚氰胺与DNA探针孵育后产生的特征信号的频率最高,可用于后续三聚氰胺检测的研究。(2)研究了三聚氰胺与DNA探针的结合方式以及其检测原理。研究发现,三聚氰胺的浓度直接影响了其特征信号的阻滞电流幅度;其中,三聚氰胺的浓度在0.1-50μM范围时与两条单链DNA形成DNA-Melamine复合物,而浓度在50-200μM时与三条单链DNA结合形成DNA-Melamine复合物。当以上不同构型的DNA-Melamine复合物进入蛋白纳米孔时,未解链成单链穿过纳米孔,而是停留在蛋白纳米孔中,产生了不可逆的电流下降,从而实现对三聚氰胺的检测。(3)基于建立的纳米孔单通道记录检测体系,开展了在缓冲液和鲜牛奶样品中三聚氰胺的定性和定量检测。在缓冲液体系中,三聚氰胺的浓度在1-100μM范围内,与特征“堵塞”信号的时间具有良好的线性关系,线性相关系数R2为0.9901,检测限为100 nM;在鲜牛奶样品体系中,三聚氰胺的浓度在10-90μM区间内,与特征“堵塞”信号的时间成线性关系,相关系数R2为0.9801,检测限为1μM;同时,鲜牛奶中可能存在的乳糖、金属离子(Mg+、Ca+、Fe+、Cu+、Zn+)和Vc以及三聚氰胺结构类似物(三聚氰酸、赖氨酸、半胱氨酸)均未对三聚氰胺检测结果产生干扰,表明该纳米孔单通道检测体系对三聚氰胺的检测具有良好的灵敏度和特异性。

关键词：纳米孔单通道记录三聚氰胺检测结合方式应用

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单通道和全细胞记录技术

中国医疗器械杂志 2000年第4期24卷 221-226,205页

作者：娄雪林周专康华光华中科技大学生物物理与生物化学研究所湖北武汉430074

离子通道的活动是可兴奋细胞传递信息的基础 ,膜片钳技术的发明导致了生命科学的一场革命。对膜片钳的工作模式、记录模式。

关键词：离子通道膜片钳单通道记录全细胞记录