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t7转录筛选器的构建及应用

T7转录筛选器的构建及应用

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作者：李陈孟北京化工大学

学位级别：硕士

转录系统是表达蛋白的重要组件,其转录强弱直接影响到启动子下游基因的表达强弱。衡量转录系统强弱的基本方法是通过在启动子下游引入报告基因,测定报告基因的表达强弱进而判断转录系统的强弱。但是影响外源蛋白表达强弱的因素较多,此外... 详细信息

转录系统是表达蛋白的重要组件,其转录强弱直接影响到启动子下游基因的表达强弱。衡量转录系统强弱的基本方法是通过在启动子下游引入报告基因,测定报告基因的表达强弱进而判断转录系统的强弱。但是影响外源蛋白表达强弱的因素较多,此外,像t7转录系统由于其转录能力超强,转录过程有时候会明显影响宿主正常的生长和代谢,因此会发生突变,降低或者丧失其转录能力。基于以上问题,通过终止子的转录通读现象构建了转录强度筛选器,在基因终止子下游插入一段筛选压力基因(“RBS—抗性基因”的结构),与终止子上游的基因构成一种多顺反子结构。转录能力强,通读概率大,抗性基因转录量就大,抗性能力就强,转录能力与抗性基因的表达量呈正相关。通过抗性强弱的检测,判断和筛选出不同转录能力的转录系统。采用改变抗生素浓度的方法,检测、筛选到转录强度不同的t7转录系统,并通过工艺控制获得自适应、稳定的t7转录系统。因此,本论文的结果包括以下四点:(1)t7转录筛选器的构建。本实验需要快速筛选出稳定的、不同强度的t7转录系统。通过改造单质粒t7表达系统,将诱导型系统改造为组成型系统,增加宿主的负担从而造成转录系统不稳定。之后,将筛选器结构引入表达载体中,替换启动子、报告基因等构建出一系列t7转录筛选器;(2)探究影响转录通读的因素。通过菌体生长曲线的测量来探究启动子、目的基因长度、目的基因结构、终止子结构等方面对转录筛选器的影响,目的基因长度越长、结构越复杂、通读率越低其生长抑制情况越明显;(3)利用筛选器来检测、筛选稳定的转录系统。通过传代实验,平均荧光强度和流式细胞仪的结果证明本论文构建得到的菌株BL21(No lacI-1×GFP-RD17)和 BL21(No lacI-1×GFP-RD7)应用壮观霉素筛选获得稳定且不同强度的转录系统;(4)采用传代实验,从报告基因的长度、基因的结构方面对筛选器的适用性进行研究,表明可通过改变抗性浓度解决稳定性问题。此外,流式细胞仪检测证明构建的转录筛选器Kt2440-RD1能够消除*** Kt2440中的非荧光细胞峰。

关键词：转录系统单质粒t7表达系统转录通读抗生素转录筛选器

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