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单细胞转录组整合分析人类肠道肥大细胞的组织间与组织内异质性

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单细胞转录组整合分析人类肠道肥大细胞的组织间与组织内异质性

作者：张景慧山东大学

学位级别：硕士

研究背景及目的肥大细胞(Mast cells,MCs)是肠道组织中重要的免疫细胞,越来越多的研究将其视为包括炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)在内的多种肠道疾病的发病基础。最近一些单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencing,scRNA... 详细信息

研究背景及目的肥大细胞(Mast cells,MCs)是肠道组织中重要的免疫细胞,越来越多的研究将其视为包括炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)在内的多种肠道疾病的发病基础。最近一些单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)研究揭示了MCs在炎症、纤维化和肿瘤中的重要作用。受多种因素的影响,MCs具有十分显著且复杂的异质性。因此,这些仅在单一组织或疾病类型中对MCs的研究,尚不能揭示MCs是如何执行其谱系共有的和其驻留器官所需的功能。本研究旨在通过整合分析多种组织和疾病状态的scRNA-seq数据以创建人类MCs单细胞图谱,重点探讨健康和疾病状态下肠道MCs在组织间与组织内的异质性,为认识MCs在疾病中的关键作用提供途径和数据资源。研究方法本研究纳入29个公开的scRNA-seq数据集,利用多种生物信息学技术对其进行数据整合和综合分析,其中包括:(1)数据预处理,包括Scrublet算法初步去除双细胞、质控、标准化和对数化等;(2)Harmony算法进行数据整合和批次效应校正;(3)主成分分析和统一流形逼近与投影算法对数据进行降维和可视化;(4)Leiden聚类分析和细胞类型注释;(5)差异表达基因和转录因子分析;(6)GSEApy进行通路富集分析。同时,使用免疫荧光染色在人类样本中对关键分子靶点进行验证。研究结果1.本研究建立了一个包含18,064个MCs的跨组织和疾病状态的人类MCs单细胞图谱。2.健康状态下,肠道MCs与肺、口腔及皮肤等屏障组织MCs共享一个能够产生蛋白酶、脂质介质及组胺的核心转录程序。同时,肠道MCs具有组织特异性特征:肠道组织中存在高表达TMSB4X(P组织相比,炎症、非炎症和纤维化组织MCs中分别有20个、9个和121个基因的表达上调;疾病状态下屏障组织的MCs中存在Diseased-MC 5和Diseased-MC两个特殊亚群,前者高表达ISG15(P组织相比,溃疡性结肠炎患者结肠炎症和非炎症区域的MCs中分别有60个和31个基因表达上调;克罗恩病患者回肠炎症和非炎症区域的MCs中分别有16个和12个基因表达上调。SLC18A2和TMEM176B的表达水平在溃疡性结肠炎患者结肠炎症区域的MCs中显著上调(P组织和疾病状态的人类MCs数据资源,更有利于对MCs异质性的探索。2.在健康状态下,与其他组织器官相比,肠道MCs表现出明显的组织特异性,且各肠段MCs差异显著,或与肠道组织独特的功能需要以及各肠段间组织微环境的差异相关。3.疾病状态显著改变了 MCs的数目和表型,或与不同疾病微环境对MCs的影响和塑造有关。4.IBD患者炎症区域的MCs数量和表型发生显著改变,且这些改变在IBD患者非炎症区域MCs中已部分出现,提示MCs参与IBD的发生和发展过程。

关键词：单细胞转录组肥大细胞异质性屏障组织炎症性肠病

单细胞转录组揭示系统性红斑狼疮患者与脓毒症患者外周循环免疫细胞的差异

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单细胞转录组揭示系统性红斑狼疮患者与脓毒症患者外周循环免疫细...

作者：张向笼南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景系统性红斑狼疮是一种严重的自身免疫性疾病,可以影响人体的各个器官和系统。由于患者的免疫系统受损,使得他们容易被细菌、真菌和病毒感染。同时,常规用于治疗该疾病的药物,如激素和免疫抑制剂等,也可能抑制患者的免疫系统,进... 详细信息

研究背景系统性红斑狼疮是一种严重的自身免疫性疾病,可以影响人体的各个器官和系统。由于患者的免疫系统受损,使得他们容易被细菌、真菌和病毒感染。同时,常规用于治疗该疾病的药物,如激素和免疫抑制剂等,也可能抑制患者的免疫系统,进而增加感染的风险。据研究表明,感染是导致系统性红斑狼疮患者死亡的主要原因之一。当机体对感染反应失调时,就会导致脓毒症的发生。脓毒症是一种危及生命的全身性炎症反应,已成为全球范围内感染致死的主要原因。它可能导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),严重威胁患者的生命安全。尽管系统性红斑狼疮和脓毒症这两种疾病有着不同的发病机制和治疗方法,但它们确实存在一些相似的临床表现。例如,由于免疫系统失调,系统性红斑狼疮患者会出现与脓毒症类似的临床症状,如呼吸困难、高热、血压异常等。这些相似的表现可能会让医生在判断病情时感到困惑,因此错过了最佳的治疗时间。因此,深入理解这两种疾病之间分子层面的差异非常关键。通过更好地了解患者的疾病状态,并选择合适的干预方式,能够有效提高患者的治疗和预后的成功率。目的本研究旨在通过单细胞转录组探究系统性红斑狼疮和脓毒症患者中不同免疫细胞类型的基因表达变化,为这些疾病的早期诊断寻找新的潜在生物标志物,加深我们对其发病机制的理解。方法在本研究中,收集系统性红斑狼疮和脓毒症患者的外周血全血样本。使用密度梯度离心分离外周血单个核细胞,然后通过活力和密度筛选鉴定细胞。过滤后筛选出优质细胞进行单细胞转录组文库构建和测序。将获得的基因表达矩阵与来自公共数据库的健康捐献者数据整合,并使用生物信息学工具进行分析,以探究两种疾病之间基因表达的异同并预测功能差异。结果1.根据纳入标准纳入3例脓毒症患者和3例系统性红斑狼疮患者。2.经过质控和过滤,共获得39,058个高质量细胞用于后续分析。3.通过聚类分群,确定了 29种不同的细胞亚群,其中包括两种γδT细胞。4.对两种γδT细胞中验证已报道的系统性红斑狼疮相关基因家族,其表达模式与文献报道的αβT细胞基因表达趋势一致,其中STAT1基因在两类γδT细胞中均具有显著差异。5.脓毒症和系统性红斑狼疮患者两种γδT细胞间差异基因通路富集分析显示,包含Toll样受体信号通路,IL-17信号通路在内的多条免疫系统通路在系统性红斑狼疮患者中显着正向富集。6.γδT细胞的细胞间通讯分析表明,它们可能通过与CD4 T细胞相互作用激活下游通路并参与免疫反应。结论与脓毒症患者相比,系统性红斑狼疮患者体内的γδT细胞可能通过与CD4+T细胞相互作用引发级联反应,显着正向丰富免疫相关通路以应对炎症反应。

关键词：系统性红斑狼疮脓毒症单细胞转录组 γδT细胞

基于单细胞转录组学分析百草枯诱导帕金森病样小鼠大脑小胶质细胞差异基因及其功能

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中华劳动卫生职业病杂志 2024年第4期42卷 248-257页

作者：郭振坤张雅婷张誉翁雅丽李煌元吴思英福建医科大学公共卫生学院福州350122

目的基于单细胞转录组测序分析百草枯(PQ)诱导的帕金森病(PD)样小鼠大脑小胶质细胞亚群差异基因和相关信号通路,为阐明PQ致动物大脑PD样改变的机制研究提供线索。方法于2021年9月,将6周龄C57BL/6雄性小鼠6只随机分为对照组和实验组(每组... 详细信息

目的基于单细胞转录组测序分析百草枯(PQ)诱导的帕金森病(PD)样小鼠大脑小胶质细胞亚群差异基因和相关信号通路,为阐明PQ致动物大脑PD样改变的机制研究提供线索。方法于2021年9月,将6周龄C57BL/6雄性小鼠6只随机分为对照组和实验组(每组3只),分别以生理盐水、10.0 mg/kg PQ进行腹腔注射,每3天1次,连续10次注射造模。染毒结束后取小鼠大脑,进行10×Genomics单细胞转录组测序。根据基因表达特征筛选小胶质细胞亚群,进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。进一步筛选实验组和对照组间小胶质细胞亚群的差异基因,利用生物信息学工具进行功能显著性富集分析。采用0、60、90μmol/L的PQ溶液处理小鼠小胶质细胞(BV2细胞),通过实时荧光定量PCR实验验证差异基因己糖激酶2(Hk2)、ATPase H+转运V0亚基b(Atp6v0b)、神经调节蛋白1(Nrg1)的表达情况。结果根据特征基因肌醇多磷酸-5-磷酸酶d(Inpp5d)和转化生长因子β受体1(Tgfbr1)将Cluster 7和Cluster 20亚群识别为小胶质细胞亚群,且该亚群反映小胶质细胞活化M2表型。生物信息学分析结果显示,所识别小胶质细胞亚群特征基因均富集到内吞作用;在分子功能方面主要富集跨膜受体蛋白激酶活性和细胞因子结合等功能。Cluster 7亚群上调基因主要富集于溶酶体通路、内吞作用等通路;下调基因主要富集于神经退行性疾病等信号通路。Cluster 20亚群上调基因主要富集于与PD相关的信号通路;下调基因主要富集于环磷酸腺苷(cAMP)信号传导途径、神经系统发育、突触功能等信号通路。实时荧光定量PCR检测结果显示,与0μmol/L比较,90μmol/L PQ溶液处理后BV2细胞的Hk2 mRNA和Atp6v0b mRNA表达水平升高,Nrg1 mRNA表达水平降低,差异均有统计学意义(P细胞在PQ诱导的PD样小鼠模型中被激活,且向M2表型极化,其功能与溶酶体(内吞)、突触功能及PD相关信号通路的调节有关。

关键词：百草枯帕金森病小胶质细胞单细胞转录组差异表达基因富集分析

基于单细胞转录组的多级别胶质瘤异质性及免疫微环境分析揭示了潜在的预后生物标志物

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生物工程学报 2022年第10期38卷 3790-3808页

作者：刘洁许凯龙马立新王洋湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062

脑胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的内在肿瘤,具有发病率高、预后较差等特点。本研究旨在鉴定多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)和低级别胶质瘤(lower-grade gliomas,LGG)之间的差异表达基因(differentially expres... 详细信息

脑胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最常见的内在肿瘤,具有发病率高、预后较差等特点。本研究旨在鉴定多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)和低级别胶质瘤(lower-grade gliomas,LGG)之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),以探讨不同级别胶质瘤的预后影响因素。从NCBI基因表达综合数据库中收集了胶质瘤的单细胞转录组测序数据,其中包括来自3个数据集的共29097个细胞样本。对于不同分级的人脑胶质瘤进行分析,经过滤得到21071个细胞,通过基因本体分析、京都基因与基因组百科全书途径分析,从差异表达基因中筛选出70个基因,我们通过查阅文献,聚焦到delta样典型Notch配体3(delta like canonical Notch ligand 3,DLL3)这个基因。基于TCGA的基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)数据库用于探索LGG和GBM中DLL3基因的表达差异,采用基因表达谱交互式分析和肿瘤免疫学估计资源(tumor immune estimation resource,TIMER)数据库,研究关键基因在不同分级的脑胶质瘤中的表达,预测了与免疫治疗密切相关的生物标志物。cBioPortal数据库用于探索DLL3表达与25个免疫检查点之间的关系。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)进一步确定了与中心基因相关的途径。最后,在中国胶质瘤基因组图谱(Chinese glioma genome atlas,CGGA)中验证了生物标志物在预后和预测中的疗效。这些结果发现,预后基因与肿瘤增殖和进展有关,通过生物学信息和生存分析,表明这些基因可能作为一种有前途的预后生物标志物,并作为选择治疗策略的新靶点。

关键词：人脑胶质瘤单细胞转录组功能注释 DLL3 免疫微环境

单细胞转录组在晚期肺腺癌患者个体化治疗中的应用

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中华实验外科杂志 2020年第5期37卷 948-950页

作者：刘亚飞叶贯超黄岚张春敭盛银良吴彬韩露董博吴春莉齐宇郑州大学第一附属医院胸外科 450052 郑州大学第一附属医院生物治疗中心 450052

目的:分析晚期肺腺癌患者肿瘤细胞异质性,探索肿瘤细胞亚群转录组特性以寻找个体特异的治疗方案。方法:从人类肿瘤相关的基因表达汇编(GEO)数据库下载肺腺癌单细胞转录组测序数据芯片编号GSE123902,包含收集于2018年至2019年于纪念斯隆... 详细信息

目的:分析晚期肺腺癌患者肿瘤细胞异质性,探索肿瘤细胞亚群转录组特性以寻找个体特异的治疗方案。方法:从人类肿瘤相关的基因表达汇编(GEO)数据库下载肺腺癌单细胞转录组测序数据芯片编号GSE123902,包含收集于2018年至2019年于纪念斯隆-凯特琳癌症中心手术切除的8例原发肺癌组织,3例脑转移样本,1例骨转移样本,1例肾上腺转移样本。过滤、鉴定并分离肿瘤细胞,对表达数据进行标准化、降维处理并根据表达模式对细胞进行聚类,利用基因差异表达分析,基因集变异分析(GSVA)探索不同肿瘤细胞亚群的表达特性。结果:共分离Ⅳ期肺腺癌原发灶肿瘤细胞211个,脑转移灶肿瘤细胞965个,骨转移灶肿瘤细胞659个,肾上腺转移灶肿瘤细胞14个。样本间比较涉及肿瘤血管生成、上皮间充质转化、侵袭转移相关的基因和基因集,例如骨转移组明显上调的波形蛋白(VIM,logFC=3.185,校正后的 P细胞亚群,存在多个耐药相关基因上调,包括脑转移细胞亚群中上调的载脂蛋白2(LCN2, logFC=1.822,校正后的 P细胞亚群中上调的趋化因子1(CXCL1,logFC=1.604,校正后的 P单细胞转录组分析肿瘤细胞异质性,可为晚期肺腺癌患者寻找个体化治疗方案提供线索。

关键词：肺腺癌单细胞转录组个体化治疗

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单细胞转录组在昆虫学研究的应用

中国农学通报 2023年第17期39卷 79-85页

作者：李媛媛德力格尔刘晶石凯内蒙古民族大学农学院内蒙古通辽028043

为了解析昆虫表型背后的基因调控机制,单细胞转录组测序克服了传统技术的缺陷,充分体现了细胞异质性,实现了细胞类型的鉴定、细胞的分化轨迹的推导、细胞间互作关系的分析。总结了单细胞转录组在昆虫学研究方面的应用,以期为昆虫表型—... 详细信息

为了解析昆虫表型背后的基因调控机制,单细胞转录组测序克服了传统技术的缺陷,充分体现了细胞异质性,实现了细胞类型的鉴定、细胞的分化轨迹的推导、细胞间互作关系的分析。总结了单细胞转录组在昆虫学研究方面的应用,以期为昆虫表型—细胞—基因的功能研究和分子机制研究提供参考借鉴。

关键词：昆虫单细胞转录组混合细胞转录组转录组学研究进展

单细胞转录组整合分析成鼠嗅球新生神经元的发展及特征

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单细胞转录组整合分析成鼠嗅球新生神经元的发展及特征

作者：许逸聪昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]利用成年小鼠室管膜下区的神经发生及其参与的嗅球神经微环路可塑性过程的特性,通过整合分析相关区域的单细胞转录组数据,探究成鼠嗅球新生神经元的发展过程及表达特征,并讨论其定位及分离获取的可行性。为神经系统再生修复及神... 详细信息

[目的]利用成年小鼠室管膜下区的神经发生及其参与的嗅球神经微环路可塑性过程的特性,通过整合分析相关区域的单细胞转录组数据,探究成鼠嗅球新生神经元的发展过程及表达特征,并讨论其定位及分离获取的可行性。为神经系统再生修复及神经环路可塑性等领域的相关研究提供基础支持。[方法]收集并筛选成鼠嗅球及室管膜下区的单细胞转录组数据。经质控及预处理,将单细胞转录组数据进行比对及注释。基于合理的筛选过程,构建各样本的表达谱矩阵并进行校正及整合。通过有效的降维及聚类算法估计各细胞类型及部分类型的亚群。利用Wilcoxon符号秩检验筛选各细胞群间的差异基因作为其表达谱特征。基于降维结果及相关性,构建各细胞发生轴的拟时间序列。通过共表达分析构建各发生轴时序相关基因的共表达模块及各模块的共表达网络,并对网络中的各模块分别进行GO功能富集分析。[结果]通过对3组单细胞转录组数据的整合分析,总共获得了 96,732个细胞及其27,375个基因的表达情况。经分类,确定了 27种细胞分类群、4种星形胶质细胞亚群,以及嗅球的5种神经元亚群。通过表达谱的降维结果,观察到了从星形胶质细胞开始的神经元发生轴及少突胶质细胞发生轴。通过拟时间序列分析分别得到了神经元发生轴时序相关基因3,023个,少突胶质细胞发生轴时序相关基因1,470个。按表达相关性分别构建了13个神经元发生轴时序相关的共表达模块,以及10个少突胶质细胞发生轴时序相关共表达模块。最后通过对比表达谱特征与现有数据库中的原位杂交结果,得到了成鼠嗅球新生神经元的3个可用于标记的分子特征。[结论]作为嗅球成体新生神经元发生过程的源头,星形胶质细胞向NPC及OPC这2个不同方向发展时,首先均表现出去分化过程。其次,星形胶质细胞向OPC转化的过程中,可以发现其在表达谱表现出向少突胶质细胞系转化的过程。而NPC轴的发展过程起初只表现出细胞增殖相关特征,于TAP阶段才开始出现神经元系转化的相关过程。其中Ptprd相关调控过程可能参与轴突与少突胶质神经胶质的黏附并调节髓鞘的形成。在NSC被激活转化为TAP的过程中,其表达改变主要涉及有丝分裂的增强与胶质细胞特征的减弱。在TAP发生的神经母细胞中,通过Sox家族相关通路的调控,神经分化相关过程开始被激活,且开始产生未成熟神经标记,而有丝分裂相关通路的特征基因表达则无显著改变,表明早期神经母细胞依然具有相当的分裂增殖能力,而其细胞周期相关过程可能受到Hmgb2通路的调控。在迁移过程中,其细胞周期调节等增殖相关过程趋于结束,整体表达谱开始向突起发生及细胞迁移等神经元分化过程转变。神经元的细胞黏附及迁移过程与受Robo2等相关信号通路调节的Cldn5、Bsg等膜蛋白黏附作用有关,同时还受到Tmsb4X等相关通路的分化抑制作用。经迁移的新生神经元到达嗅球后,其分化成熟过程受到Calm2相关的钙离子信号的调节,这些被调控的过程主要包括神经突起延伸、突触形成及突触囊泡转运等。而其在嗅球的径向迁移加入神经微环路的过程,则可能与受嗅觉活动调节的Prok2等相关通路有关。此外,在成鼠嗅球新生神经元中Prokr2作为膜受体蛋白且具有较高细胞特异性,可用于嗅球新生神经元的分选及获取。

关键词：成体神经发生成体神经干细胞小鼠嗅球单细胞转录组

三代测序和单细胞转录组测序技术在家畜雄性生殖领域的研究进展

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中国草食动物科学 2024年第3期44卷 59-65页

作者：王兴东郭宪中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃省牦牛繁育重点实验室农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室兰州730050

雄性家畜优良的繁殖性能可以提高养殖效益,促进家畜种群的改良和生产性能的提升,而睾丸正常发育是雄性哺乳动物精子发生及有效繁殖力的先决条件。近年来,高通量测序技术已广泛应用于哺乳动物睾丸发育及精子发生的各项研究中。其中三代... 详细信息

雄性家畜优良的繁殖性能可以提高养殖效益,促进家畜种群的改良和生产性能的提升,而睾丸正常发育是雄性哺乳动物精子发生及有效繁殖力的先决条件。近年来,高通量测序技术已广泛应用于哺乳动物睾丸发育及精子发生的各项研究中。其中三代测序和单细胞转录组测序技术已经成为深入研究家畜雄性生殖及精子发生机制的有效工具。文章综述了雄性睾丸发育,三代测序和单细胞转录组测序技术及其在睾丸发育中的应用和研究进展,揭示出与雄性生殖发育相关的关键基因和途径,为提高家畜的繁殖效率及研究生殖疾病的病因提供参考依据。

关键词：三代测序单细胞转录组雄性生殖

基于单细胞转录组和类器官模型探讨沙蟾毒精通过Notch通路干预结直肠癌增殖的研究

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中华中医药学刊 2024年

作者：商志浩钱景阳赖岳阳程海波南京中医药大学第一临床医学院江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心

目的基于单细胞转录组测序和类器官模型探讨沙蟾毒精抑制结直肠癌的效果和机制。方法通过对沙蟾毒精和PBS干预的结直肠癌移植瘤进行单细胞测序，基于测序结果分析占比减少的肿瘤细胞亚群及其生物学功能；5-Ethynyl-2’-deoxyuridine... 详细信息

目的基于单细胞转录组测序和类器官模型探讨沙蟾毒精抑制结直肠癌的效果和机制。方法通过对沙蟾毒精和PBS干预的结直肠癌移植瘤进行单细胞测序，基于测序结果分析占比减少的肿瘤细胞亚群及其生物学功能；5-Ethynyl-2’-deoxyuridine（EDU）实验用于观察沙蟾毒精对于HCT 116细胞增殖的抑制能力；西方印迹（Western Blotting）实验用于验证凋亡相关蛋白和Notch通路中相关蛋白在沙蟾毒精干预后的表达改变；最后我们对类器官进行了苏木精-伊红染色（HE）及免疫组织化学染色（IHC）来评估沙蟾毒精对于类器官的抑制效果。结果单细胞转录组测序结果显示第二群肿瘤细胞亚群在干预后比例显著降低，PBS组中占比21.57%，Are组中占比14.16%，富集分析显示这群肿瘤细胞与蛋白质运输、由RNA聚合酶II调控的转录、囊泡介导的运输、基于DNA模板的转录负向调控、从内质网到高尔基体的囊泡介导运输、细胞凋亡过程、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、癌症中的蛋白多糖、泛素介导的蛋白质降解、癌症途径、Notch信号通路、Wnt信号通路等生物学进程相关，EDU实验显示，与PBS组相比，沙蟾毒精在100nm-300nm间浓度依赖性地抑制HCT116细胞增殖；Western blot 结果显示，与PBS组相比，沙蟾毒精显著抑制了BAX的表达，并提高BCL-2的蛋白表达。与Notch通路相关的Notch1、Jagged1、HES1、Cyclin D1和DLL4蛋白都出现了不同程度的表达抑制。结论沙蟾毒精能够抑制结直肠癌增殖，其机制可能与抑制Notch通路激活有关。

关键词：单细胞转录组肠癌类器官 NOTCH通路沙蟾毒精