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脊髓性肌萎缩症单体型连锁分析和单细胞扩增方法的建立及应用研究

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脊髓性肌萎缩症单体型连锁分析和单细胞扩增方法的建立及应用研究

作者：苏峻峰福建医科大学

学位级别：硕士

目的：1、优化脊髓性肌萎缩症(SMA)产前基因诊断体系。 2、建立单细胞扩增技术平台。 3、应用单细胞扩增方法对SMA进行基因诊断研究。方法：1、应用聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)技术对和运动神经元生存基因(SMN)紧密连... 详细信息

目的：1、优化脊髓性肌萎缩症(SMA)产前基因诊断体系。 2、建立单细胞扩增技术平台。 3、应用单细胞扩增方法对SMA进行基因诊断研究。方法：1、应用聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)技术对和运动神经元生存基因(SMN)紧密连锁的短串联重复(STR)位点进行等位频率分析。 2、联合运用PCR-限制性酶切、变性高效液相色谱(DHPLC)、STR连锁分析及基因扫描技术对SMA家系进行产前诊断。 3、应用巢式PCR、引物延伸预扩增(PEP)及荧光PCR对单个淋巴细胞进行扩增。 4、应用PCR-限制性酶切技术对正常人及SMA患者单个淋巴细胞进行SMN1缺失检检测。结果：1、从11个与SMN基因连锁的STR位点中优选出了3个多态信息含量丰富、杂合率高的位点。 2、应用优选出的3个STR位点(D5S435、D5F149、D5S351)进行SMA家系连锁分析，并联合应用基因扫描、PCR-限制性酶切及DHPLC进行产前基因诊断，结果准确、可靠。 3、用巢式PCR、引物延伸预扩增法扩增单细胞，扩增率分别为90％和85％。 4、巢式PCR、引物延伸预扩增单细胞SMN基因7、8号外显子，PCR产物进行限制性酶切，结果和从全血中抽提DNA后PCR-限制性酶切结果一致。结论：1、联合PCR—限制性酶切、DHPLC、STR连锁分析及基因扫描技术使SMA产前诊断结果更准确、可靠。

关键词：脊髓性肌萎缩症(SMA) 短串联重复序列(STR) 单体型连锁分析单细胞扩增基因扫描

单细胞扩增技术在植入前诊断中的应用和研究进展

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中国优生与遗传杂志 2006年第4期14卷 5-6,14页

作者：苏峻峰王柠福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005

近10几年来,随着植入前诊断的迅速发展,避免了许多遗传病患儿的出生。植入前诊断是建立在单细胞扩增技术基础之上的,完善的单细胞扩增技术的建立是准确植入前诊断的前提和保障。本文综述了近几年单细胞扩增技术在植入前诊断中的应用和... 详细信息

近10几年来,随着植入前诊断的迅速发展,避免了许多遗传病患儿的出生。植入前诊断是建立在单细胞扩增技术基础之上的,完善的单细胞扩增技术的建立是准确植入前诊断的前提和保障。本文综述了近几年单细胞扩增技术在植入前诊断中的应用和研究进展。

关键词：植入前诊断单细胞扩增聚合酶链反应

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巴西橡胶树小孢子单细胞体外扩增体系的优化

分子植物育种 2021年第17期19卷 5869-5877页

作者：王宇翔杨星星刁艳茹刘红东王英庄南生高和琼海南大学热带作物学院海口570228 中国热带农业科学院橡胶研究所儋州571737

高质量单细胞的获得且进行高效率的扩增是单细胞测序的前提,而植物细胞因为存在细胞壁使得单细胞扩增变得困难。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’幼嫩雄花为试验材料,使用5种不同的酶液在不同的时间和渗透压稳定剂下探索获得高质量且... 详细信息

高质量单细胞的获得且进行高效率的扩增是单细胞测序的前提,而植物细胞因为存在细胞壁使得单细胞扩增变得困难。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’幼嫩雄花为试验材料,使用5种不同的酶液在不同的时间和渗透压稳定剂下探索获得高质量且易扩增的巴西橡胶树小孢子单细胞,同时对单细胞扩增过程进行相应的探索优化。结果表明,使用8%纤维素酶+6%果胶酶+3%蜗牛酶混合酶,0.6 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,37℃酶解45 min后可以得到品质优良的巴西橡胶树小孢子单细胞;单细胞扩增过程确定细胞裂解酶用量为0.5μL,细胞裂解时间为80 min,预扩增循环数为10个循环,可以得到准确且覆盖度高的单细胞扩增产物,经Dot-blot杂交验证其确实来自于巴西橡胶树基因组。本研究为后续巴西橡胶树单细胞全基因组测序,构建巴西橡胶树高分辨SNP遗传图谱提供基础性技术支持。

关键词：巴西橡胶树(Hevea brasiliensis) 四分体单细胞扩增 Dot-blot杂交

多重链置换扩增技术的优化及其在单细胞中的应用

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多重链置换扩增技术的优化及其在单细胞中的应用

作者：杨芳东南大学

学位级别：硕士

多重链置换扩增技术(MDA)是目前使用较为广泛的全基因组扩增技术,使用具有保真性高、持续合成能力强的phi29 DNA聚合酶和6N随机引物,可用于低起始量基因组DNA或单细胞样本的扩增,具有较高的扩增效率和均一性等优点。同时,MDA反应在常温... 详细信息

多重链置换扩增技术(MDA)是目前使用较为广泛的全基因组扩增技术,使用具有保真性高、持续合成能力强的phi29 DNA聚合酶和6N随机引物,可用于低起始量基因组DNA或单细胞样本的扩增,具有较高的扩增效率和均一性等优点。同时,MDA反应在常温下进行,操作简单、方便。由于具有上述技术优势,MDA技术在分子生物学的各个领域都有广泛应用,包括个体医疗、法医诊断、考古学和肿瘤的早期诊断等。根据目前的研究结果,MDA扩增反应效果受多种因素影响,包括:核酸模板起始量、缓冲液中Mg浓度、反应温度和反应时间等。为进一步加深对MDA反应的认识,优化反应参数,本论文针对可能影响MDA扩增反应效果的诸多因素分别展开研究,比较了不同参数条件下的扩增效果,并在此基础上发展了用于单细胞全基因组扩增的MDA反应体系及技术流程,论文主要的研究内容如下:1.在MDA扩增技术相关研究进展综述的基础上,选择核酸模板起始量、缓冲液中Mg浓度、反应温度和反应时间等四个参数作为研究对象,对不同参数条件下的MDA扩增效果进行比较和分析,绘制扩增效率曲线。结果表明:核酸模板的起始量对MDA反应的最终扩增产物量影响较小,6-600pg的核酸模板均可以扩增产生600 ng/μL左右的扩增产物;不同的Mg浓度对扩增产物量影响较大,Mg的浓度在10-15mmol/L MDA反应扩增效率最高;扩增反应的时间对扩增产量有一定的影响,基于标准扩增体系,当反应时间不足8h时,扩增产物量持续增长,8h时达到平台,其后产量不再随扩增时间的增加而提高;反应温度对MDA的扩增产量影响较大,当温度低于20℃或高于40℃时,扩增反应几乎无法进行,温度在25-35℃之间时,扩增反应可以进行,其中30℃时扩增效率最高,进一步高通量测序分析表明温度在30-35℃之间扩增一致性最高。2.在完成不同扩增参数的比较后,本论文优选了扩增产量高、扩增一致性高的参数,优化发展了用于单细胞样本处理的全基因组扩增流程。单细胞全基因组扩增流程包括:单细胞的获取、细胞裂解与中和、MDA扩增。论文以YH-1细胞系单细胞为研究对象,采用看家基因扩增的方式评价扩增产物基因组的完整性,基于变异系数分析和测序效率分析评价MDA的扩增效果。结果表明:本论文构建的单细胞全基因组扩增流程可有效实现单个细胞的全基因组扩增,重复性好,扩增产物可覆盖40%左右的基因组,相关技术参数与目前已报道的单细胞基因组测序研究的水平相当。

关键词：多重链置换扩增技术高通量测序技术扩增一致性单细胞扩增看家基因

高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

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畜牧兽医学报 2022年第11期53卷 3866-3879页

作者：胡智辉王欢衡诺巩建飞王忆王雅春赵善江朱化彬中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室北京100193 中国农业大学北京100193

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并... 详细信息

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells,TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification,WGA),对扩增成功且DNA量大于1000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示:1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22.2±14.7)%。2)1/2体内胚组和体外2细胞组扩增成功率为100%,而体内TE组、体外TE组和体外8细胞组扩增的成功率分别为(94.4±5.6)%、(76.2±9.5)%和(60.0±24.5)%;与1/2体内胚组相比,体内TE组和体外TE组经WGA后DNA量均显著下降(P扩增后DNA量显著低于体内TE组(P细胞组(76.1±6.9)%、体外8细胞组(61.2±19.0)%芯片检出率均显著下降(P细胞骨架和细胞分化相关,而体内TE组缺失基因则主要与细胞物质分泌和运输相关。5)在64958个SNPs填充位点中52334个SNPs填充位点的填充准确性(R~2)在0.99~1之间且填充准确性为91%,说明填充的准确率较高,育种值估计显示,体外TE组生产性能低于体内TE组。综上,利用胚胎切割、单细胞基因组扩增和基因组芯片可在微创的前提下,实现对植入前早期胚胎染色体质量和生产性能的评估。同时,体内外胚胎染色体缺失片段对比分析发现体外发育过程中细胞骨架等基因异常表达可能是导致体外胚胎质量差的原因之一。

关键词：牛胚胎胚胎切割单细胞扩增 SNP芯片胚胎质量

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牛早期胚胎生产性能评价方法的初步研究

牛早期胚胎生产性能评价方法的初步研究

作者：胡智辉中国农业科学院

学位级别：硕士

牛胚胎生产与移植技术可以充分利用优秀种公牛和优秀母牛的遗传资源,获得大量具有高遗传品质的牛胚胎,对于良种母牛繁殖潜力的挖掘、快速扩繁以及种质资源保护具有重要的价值。但是移植前胚胎的生产性能无法确定,且体外胚胎移植后妊娠... 详细信息

牛胚胎生产与移植技术可以充分利用优秀种公牛和优秀母牛的遗传资源,获得大量具有高遗传品质的牛胚胎,对于良种母牛繁殖潜力的挖掘、快速扩繁以及种质资源保护具有重要的价值。但是移植前胚胎的生产性能无法确定,且体外胚胎移植后妊娠率和活产率普遍偏低。因此,本试验利用胚胎切割、单细胞基因组扩增(single-cell whole-genome amplification,sc WGA)和SNP芯片技术,旨在建立一种可评估牛早期胚胎生产性能的方法,为牛胚胎产业化应用提供技术支撑。试验选择扩增成功且DNA量大于1000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和芯片填充。结果表明:1.切割部分滋养层细胞(Trophoblast cells,TE)后,体内TE组(切取体内胚胎少量TE)剩余部分和体外TE组(切取体外胚胎少量TE)剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2个体内胚(胚切取半个胚胎)剩余部分的发育率显著降低,仅为(22.2±14.7)%。因此,切取少量TE对体内外胚胎随后的发育率影响不大。2.1/2体内胚组和体外2-细胞组(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)扩增成功率为100%,而体内TE组、体外TE组和体外8-细胞组(切取体外8细胞的1个卵裂球)扩增的成功率分别为(94.4±5.6)%、(76.2±9.5)%和(60.0±24.5)%。1/2体内胚组、体内TE和体外TE组经WGA后DNA量分别为(3277.69±105.41)ng、(2206.68±59.54)ng、(1742.49±85.67)ng;与1/2体内胚组相比,体内TE组和体外TE组扩增后DNA量均显著下降(P扩增后DNA量显著低于体内滋养层组(P细胞组(76.1±6.9)%、体外8-细胞组(61.2±19.0)%芯片检出率均显著下降(P扩增后DNA量与芯片检出率关联分析发现两者相关度为0.71。4.本试验使用的芯片包含95257个SNP位点,共填充64958个SNP位点,其中填充准确性在0.99-1之间的SNP位点有52334个。同时计算本次填充的准确性为91%,说明填充的准确性较高,且各组基因组估计育种值差异明显。5.如果以至少连续7个SNP缺失作为染色体片段缺失筛选标准,体外TE组和体内TE组分别筛选到188个和388个染色体缺失片段;进一步对上述片段进行基因筛选发现体外TE组和体内TE组缺失片段各包括46个和48个基因;GO和KEGG富集分析结果显示体外TE组缺失基因主要与细胞骨架和细胞分化相关。结论:1.利用胚胎切割、单细胞基因组扩增技术获得了一种有效的胚胎切割取样策略,既可以保证芯片检测前的DNA质量,也可以保证芯片填充后的基因组育种值估计。2.胚胎发育过程中细胞骨架等功能基因异常可能是胚胎异常频率较高的原因之一。

关键词：体外胚胎胚胎切割单细胞扩增全基因组选择胚胎质量

结合单细胞RT-PCR技术与抗体组测序技术快速合成人源化单克隆抗体

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结合单细胞RT-PCR技术与抗体组测序技术快速合成人源化单克隆抗体

作者：管茜南方医科大学

学位级别：硕士

目的:抗体是生物化学、分子生物学以及临床药物研究领域中常用到的工具。至今已有43种单克隆抗体被美国FDA批准为临床用药,用于肿瘤、自身免疫性疾病以及感染性疾病的治疗[1,3]。从1975年Milstein和Kohler所发明了杂交瘤技术以来[2],新... 详细信息

目的:抗体是生物化学、分子生物学以及临床药物研究领域中常用到的工具。至今已有43种单克隆抗体被美国FDA批准为临床用药,用于肿瘤、自身免疫性疾病以及感染性疾病的治疗[1,3]。从1975年Milstein和Kohler所发明了杂交瘤技术以来[2],新的单克隆抗体制备技术不断发展,如杂交瘤技术,噬菌体展示技术,核糖体展示技术,mRNA展示技术等,这些技术也已广泛被用于筛选抗原表位。但是无论是杂交瘤技术还是新发展的各种表面展示技术,其操作复杂、耗时长仍远远不能满足科研和临床对单克隆抗体的大量需求。随着二代测序技术的发展,越来越多的抗体遗传信息被破译出来[4],本研究中作者将抗体组最新研究方法应用于人源化单克隆抗体的生产制备中,完善体外大量制备人源化单克隆抗体的流程。方法:本研究结合了单细胞RT-PCR技术以及抗体组测序技术来合成人源化的单克隆抗体。在原核表达系统大量表达蛋白人p53蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔2只,然后从耳缘静脉取出外周血,分离外周血中的B细胞,通过流式分选仪将特异性记忆B细胞分选到提前装有特殊裂解液的96孔板中,裂解并逆转录生成cDNA。用特殊设计的抗体引物通过巣式PCR体系以扩增出抗体分子的可变区。然后将此可变区克隆进新的真核表达载体,构建完成的轻链和重链载体共转染293T细胞,培养一定时间后,收集细胞培养上清,分离并检测其中的抗体。结果:通过本研究的探索,我们结合单细胞RT-PCR技术成功扩增出6个细胞内的抗体重链与轻链基因,快速合成了具有生物功能的人源化单克隆抗体。此外,通过对基因序列信息的测序、比对及分析,我们发现新西兰大白兔体内抗体轻链的突变率明显高于重链的突变率,这一点不同于人类与小鼠,说明在新西兰大白兔的抗体生成与演变过程中,轻链基因的重排可能也扮演了较为重要的角色。

关键词：单细胞扩增单克隆抗体抗体组测序 BCR 记忆B细胞

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胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒评价

分子诊断与治疗杂志 2022年第7期14卷 1104-1108页

作者：曲守方黄传峰于婷黄杰中国食品药品检定研究院北京100050

目的使用胚胎植入前染色体非整倍体国家参考品,评价胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒(半导体测序法)的性能。方法取国家参考品进行细胞裂解及片段化,制备文库,进行文库的扩增和单细胞扩增后纯化。将纯化的单细胞扩增DNA片段化和纯... 详细信息

目的使用胚胎植入前染色体非整倍体国家参考品,评价胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒(半导体测序法)的性能。方法取国家参考品进行细胞裂解及片段化,制备文库,进行文库的扩增和单细胞扩增后纯化。将纯化的单细胞扩增DNA片段化和纯化后,进行末端修复、加上接头以及PCR扩增等步骤,构建文库。将文库纯化后进行定量。使用基因测序仪BioelectronSeq 4000进行测序。使用试剂盒配套的全自动分析软件对测序数据进行信息分析,报告样本的染色体异常情况。结果对于65个异常片段大于4 Mb的国家阳性参考品,试剂盒均能检出对应的染色体异常,检出率为100%;国家阳性参考品19-del(7)-25.3 M在7号染色体100.5 Mb-125.8 Mb位置存在片段大小约25.3 Mb的拷贝数缺失,Z-score为-28.6,其他国家阳性参考品的相应异常区域对应的染色体Z-score均>3或3或0.0001;如国家阴性参考品97-NC1在1-22号染色体和性染色体区域内均未检测出异常区域。对30%嵌合的嵌合体样本检出率为50%(3/6),相对应的70%嵌合体样本检出率为83.3%(5/6);国家嵌合体参考品110-0.3-del(4)-37.7M中,30%嵌合比例细胞在4号染色体153.1 Mb-190.8 Mb位置存在大小约37.7 Mb拷贝数缺失,其Z-score为-16.5;70%嵌合比例细胞的在15号染色体23.6 Mb-28.5 Mb位置存在大小约4.9 Mb拷贝数缺失,其Z-score为-10.5,结果显示30%嵌合和70%嵌合的细胞均正确检出。结论胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒能够符合胚胎植入前染色体非整倍体国家参考品的要求。

关键词：胚胎植入前非整倍体筛查胚胎植入前遗传学筛查单细胞扩增非整倍体嵌合体高通量测序

法医DNA检验中新技术、新方法、新遗传标记的应用

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法医DNA检验中新技术、新方法、新遗传标记的应用