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稻瘟菌无毒基因单碱基变异及启动子SSR的研究

稻瘟菌无毒基因单碱基变异及启动子SSR的研究

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作者：余欢杭州师范大学

学位级别：硕士

稻瘟病是世界范围内的真菌病害,严重影响水稻的产量及品质,造成大量减产。稻瘟菌除了能侵染水稻外,还可以侵染禾本科和莎草科等多种植物,已有研究表明稻区草类寄主的梨孢菌与稻瘟病的发生存在关系。广大生产者经过多年的努力,发现抗性... 详细信息

稻瘟病是世界范围内的真菌病害,严重影响水稻的产量及品质,造成大量减产。稻瘟菌除了能侵染水稻外,还可以侵染禾本科和莎草科等多种植物,已有研究表明稻区草类寄主的梨孢菌与稻瘟病的发生存在关系。广大生产者经过多年的努力,发现抗性品种的选育及大面积推广是防治稻瘟菌最经济、最有效和最安全的解决方法。由于稻瘟菌高变异性和特异菌株的富集,致使种群演替迅速,田间的水稻抗性品种在连续使用3-5年后,明显衰退,抗病无法持久化。大量表明水稻抗病持久化与稻瘟菌无毒基因存在密切关系。稻瘟菌无毒基因是稻瘟菌中一类可识别寄主相应抗性基因的激发子。在稻瘟菌侵染水稻的过程中,有些激发子优先在BIC处积累,然后转移到水稻细胞质中;有些激发子在EIHM处积累。无毒基因经常发生变异,常见的有点突变、插入、缺失等,为了克服其变异,寄主植物也会发生变异,使得寄主植物和病原菌不断进化,最终达到平衡状态。因此,对稻瘟菌无毒基因的研究将有助于了解稻瘟菌的致病机制、水稻抗病机制以及水稻-稻瘟菌的互作,最终实现抗病的持久化。本研究以实验室收集和保存的1978年-2013年间192株稻瘟菌为研究材料,对其进行系统进化分析及无毒基因单碱基变异检测的方法的初探,结果表明(1)这些菌株聚在两个分支上,寄主为水稻、牛筋草、狗尾草的菌株菌株为一个分支上,说明这些寄主菌株的亲缘关系较近,而寄主为马唐的菌株聚在另一个分支上,表明该分支上的菌株与其它菌株亲缘关系较远。(2)8个无毒基因的变异类型是缺失,AVR-pii、AVR-pia、PWL1在供试菌株中表现出了大量的缺失现象,而AVR-Pik/km/kp、AVRPiz-t、PWL2、PWL3、PWL4在小部分菌株中表现出缺失现象。通过统计无毒基因在不同寄主中的扩出率发现没有一个菌株中存在所有的无毒基因。而在四个寄主来源的菌株中均含有无毒基因AVR-Pik/km/kp、AVRPiz-t、PWL2,且有较高的扩出率。这也说明了无毒基因的正常扩出掩盖了其可能发生了单碱基变异的事实。(3)通过对稻瘟菌中AVR-Pik/km/kp、AVRPiz-t、PWL2的序列测定及分析,发现AVRPiz-t没有发生单碱基的变异,而AVR-Pik/km/kp、PWL2存在单碱基的变异。(4)以AVRPiz-t在稻瘟菌中是否存在单碱基变异情况为例,探索了一种研究稻瘟菌群体无毒基因单碱基的变异的方法,结果表明该方法是可行的。此外,SSR在生物基因组中广泛存在,并且启动子区域的SSR与基因表达有关。稻瘟菌的基因组中存在丰富的SSR,已有报道将SSR作为分子标签对稻瘟菌进行了研究,但是稻瘟菌启动子区域的SSR几乎未见报道。因此本研究对启动子区域的SSR进行的统计分析,得到稻瘟菌中启动子SSR的分布特征及与转录的关系:稻瘟菌基因间有大量重叠现象且起始密码子之间的距离较近,起始密码子附近SSR有明显的富集现象,表明稻瘟菌启动子区域的SSR与基因的转录有一定的关系。

关键词：稻瘟菌核糖体DNA转录间隔区无毒基因单碱基变异微卫星

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水稻Wx基因第10外显子单碱基变异位点SNP10C/T效应分析

水稻Wx基因第10外显子单碱基变异位点SNP10C/T效应分析

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作者：陈盛杰扬州大学

学位级别：硕士

水稻胚乳中直链淀粉含量是影响稻米品质最主要的因素,而其主要受蜡质基因(Waxy,Wx)调控。Wx基因的等位变异是造成稻属中直链淀粉含量广泛变异的重要原因;挖掘并研究新的等位变异位点,可进一步揭示稻米品质形成及其变异的遗传机理,更可... 详细信息

水稻胚乳中直链淀粉含量是影响稻米品质最主要的因素,而其主要受蜡质基因(Waxy,Wx)调控。Wx基因的等位变异是造成稻属中直链淀粉含量广泛变异的重要原因;挖掘并研究新的等位变异位点,可进一步揭示稻米品质形成及其变异的遗传机理,更可为稻米品质改良提供新的基因资源和途径。在前期的实验中,我们鉴定了一个控制稻米高直链淀粉含量但低淀粉粘滞性的Wx等位基因,Wxlsv。通过序列比对,发现Wxlsv与Wxa的编码区仅在第10外显子处存在一个单碱基C-T差异,我们将该单碱基变异位点命名为SNP10C/T。对其它已知Wx等位基因测序发现,只有Wx2在该位置处为T,其它Wx等位基因都是C,与Wxlsv相同。为明确此单碱基差异在稻米淀粉品质形成调控中的分子机理,开展了以下研究:1、构建了Wxa与Wxlsv的功能验证表达载体,并转化糯稻Nip(wx),与未转化对照Nip(wx)相比,转基因植株基本农艺性状没有受到影响,但是籽粒变得透明。Nip(wx)-Wxlsv与Nip(wx)-Wxa转基因稻米相比,表观直链淀粉含量显著提高,胶稠度下降,淀粉粘滞性显著降低。同时又将Wxlsv表达载体单独转化Nip(Wxa),相较于对照Nip(Wxa),Nip(Wxa)-Wxlsv转基因稻米的直链淀粉含量上升,胶稠度变软,同时粘滞性也明显降低。以上结果证明了SNP10C/T是造成Wxlsv高直链淀粉含量、低淀粉粘滞性的关键突变。2、对不同背景下Wx基因的近等基因系进行分析,发现Wxlsv与Wxa在转录水平和翻译水平上无明显差异,但Wxlsv编码的GBSS Ⅰ的酶活要显著高于Wxa编码的GBSS Ⅰ;通过同源建模发现Wxlsv与Wxa第10外显的C-T差异所导致的氨基酸替换并没有造成编码的GBSSⅠ蛋白二级结构的改变;磷酸化测序发现,Wxa编码的GBSSⅠ的第415位丝氨酸残基存在磷酸化修饰,而Wxlsv编码的GBSS Ⅰ的第415位脯氨酸则未被修饰,说明SNP10C/T导致的GBSS Ⅰ第415位脯氨酸-丝氨酸的替换可能改变了磷酸化修饰的水平,从而调控了GBSSⅠ的酶活,进而影响了稻米的理化品质。3、为探究SNP10C/T在其它Wx等位基因中对稻米品质的效应,构建了Wxmp、Wxb与Wxin的表达载体,以及各自第10外显子第115位碱基定点突变成T的表达载体Wxmp-10T,Wxb-1OT与Wxn-1OT,转化Nip(wx);稻米理化品质分析发现该SNP在三种不同背景下都会造成直链淀粉含量的下降,从而影响籽粒的透明程度,但下降的幅度因背景而异;在Wxmp、Wxb这两类极低直链淀粉、低直链淀粉类型的Wx基因背景下,该SNP会造成淀粉粘滞性的降低,但在Wxin这种中间型或者Wxlsv这种高直链淀粉类型的Wx基因背景下,该SNP却会导致淀粉粘滞性的升高。

关键词：稻米品质直链淀粉含量 Wx基因单碱基变异功能分析

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二化螟Ty3/gypsy反转座子的克隆与序列分析

二化螟Ty3/gypsy反转座子的克隆与序列分析

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作者：李晓欢南京农业大学

学位级别：硕士

二化螟为钻蛀性害虫,广泛分布于我国各水稻产区,近年来危害加重。二化螟分布广且呈现周期性爆发的特点,这可能与其种群的遗传多样性及其在不同生境中的遗传适应分子机制相关。反转录转座子是宿主体内可以移动的DNA序列,当反转录转座子... 详细信息

二化螟为钻蛀性害虫,广泛分布于我国各水稻产区,近年来危害加重。二化螟分布广且呈现周期性爆发的特点,这可能与其种群的遗传多样性及其在不同生境中的遗传适应分子机制相关。反转录转座子是宿主体内可以移动的DNA序列,当反转录转座子在宿主体内转座以及增殖时,变异不断被积累遗传,最终导致种群的分化以及物种的变异。大量证据表明反转录转座子是生物基因组进化的重要动力,同时也是物种多样性形成的主要来源。转座子已成为研究基因功能与表达调控、生物多样性及生物进化机制的重要工具(或标记)。研究发现,二化螟体内含有大量的反转录转座子序列。因此,我们试图利用二化螟体内的内源性反转座子对二化螟的种群遗传多样性进行研究。本文利用二化螟体内已知的一条Ty3/gypsy反转座子序列片段,通过反向PCR和基因组步移等方法成功克隆获得了一条完整的Ty3/gypsy反转座子序列,对该反转座子序列进行了较系统的研究与分析。再者,对二化螟Ty3/gypsy反转座子序列中的天冬氨酰蛋白酶(AP)基因进行了较系统的研究与分析。最后,对二化螟体内两种类型转座子序列的单碱基变异特点进行了细致的比对分析。本文的研究,一方面使我们对二化螟Ty3/gypsy内源性反转座子的序列结构特征等有了一个系统性的认识;另一方面,通过对这两种类型转座子序列变异的研究,使我们对二化螟内源性反转座子序列的变异特点有了深刻的了解。可以将新克隆获得的二化螟Ty3/gypsy反转座子进一步用于二化螟地理种群遗传多样性的研究,将二化螟种群发生与变异的生态因素和内源分子遗传因素相结合,认识与二化螟种群遗传多样性相适应的分子形成机制。为阐明二化螟种群消长和爆发成灾的遗传适应机制提供理论依据。一、二化螟Ty3/gypsy反转座子的克隆与序列分析基于二化螟转录组数据库中的一条Ty3/gypsy类反转座子序列片段,利用反向PCR和Genome Walking方法成功克隆出Ty3/gypsy类反转座子的全长序列,命名为Csu-Ty3 (GenBank登录号：KJ191261)。该序列全长4939bp,在基因组上插入的靶位点是‘’AACGT",两端的LTR不完全相同,5’端LTR长161 bp,3’端LTR长168bp,两者的一致度为93.5%.经ORF Finder分析,Csu-Ty3中包含三个独立的ORF,从左到右依次编码GAG蛋白、AP蛋白和一个多聚蛋白。Southern杂交显示二化螟不同地理种群中均有较多的Csu-Ty3拷贝。在特定基因座位上,除了德阳和江津种群中有些个体在该位点上没有检测到Csu-Ty3拷贝的插入,其余种群中在该位点上均含有Csu-Ty3拷贝的插入。二、二化螟Ty3/gypsy反转座子天冬氨酰蛋白酶(AP)序列的克隆与分析本文首次系统研究了二化螟Ty3/gypsy反转座子的AP基因序列(GenBank: KF886014)。AP基因具有独立的开放阅读框,长528 bp,编码的蛋白含175个氨基酸残基。该蛋白中含有一个特异的Asprotease保守功能域。对同一基因座位上的AP序列多重比对分析,发现共存在46处碱基替换,其中碱基转换有31处,碱基颠换有15处,A→G的变异形式出现最多,有15处;其次是T→C的变异形式,有11处;其余的变异形式都很少,但绝大部分拷贝的ORF完整,能编码完整的蛋白。三、二化螟体内两种类型转座子单碱基变异特点分析利用多重序列比对分析软件,分别对二化螟体内发现的DNA型转座子和RNA型转座子进行独立的多重序列比对分析,发现这两种类型的转座子序列在单个碱基的替换中表现出相似的特点。单碱基的转换数均显著高于颠换数。在单碱基转换形式中,A::T→G::C的变异数均显著高于G::C→A::T,这与其他类似的研究结果明显不同。进一步对ORF区内单个碱基变异特点进行分析,结果显示在密码子的3个不同位置,发生单碱基替换的概率无显著差异。单碱基替换导致的氨基酸错义突变显著高于其他类型的氨基酸突变。密码子第3位上碱基替换导致的氨基酸同义突变数是最高的。

关键词：二化螟反转座子 Ty3/gypsy 克隆序列分析单碱基变异

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