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生物医学工程学杂志 2023年第2期40卷 313-319页

作者：杨飘张亚晰夏粱梅建东范锐黄宇刘伦旭陈维之无锡臻和生物科技有限公司江苏无锡214000 四川大学华西医院胸外科成都610041

如何提高循环肿瘤DNA(ctDNA)信号的获取能力以及判定低频信号的真实性是肿瘤微小残留病灶(MRD)检测的难点问题。本研究开发了多变异联合置信概率分析的MRD生物信息学算法(MinerVa),并在ctDNA标准品和早期非小细胞肺癌患者血浆DNA样本中... 详细信息

如何提高循环肿瘤DNA(ctDNA)信号的获取能力以及判定低频信号的真实性是肿瘤微小残留病灶(MRD)检测的难点问题。本研究开发了多变异联合置信概率分析的MRD生物信息学算法(MinerVa),并在ctDNA标准品和早期非小细胞肺癌患者血浆DNA样本中对算法效能进行评估。结果显示,MinerVa算法对多变异共追踪的特异性稳定在99.62%~99.70%,当追踪30个变异时,可检测低至6.3×10^(-5)变异丰度的变异信号;进一步对27例非小细胞肺癌患者的数据进行分析,ctDNA-MRD动态监测复发的特异性为100%,灵敏度为78.6%。数据表明MinerVa算法可高效地捕获血液ctDNA信号,在MRD检测中具有较好的准确性。

关键词：循环肿瘤DNA 微小残留病灶多变异联合置信概率分析技术噪音基线单碱基分辨率

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基于测序技术的核糖核酸修饰定位分析方法研究进展

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色谱 2024年第7期42卷 632-645页

作者：熊军冯甜袁必锋武汉大学公共卫生学院湖北武汉430071

迄今为止,已在核糖核酸(RNA)中发现了170多种不同的化学修饰,这些修饰分布在各种类型的RNA中,包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和小核RNA(snRNA)等。RNA修饰在广泛的生物过程中发挥着至关重要的作用,如调节基因表达... 详细信息

迄今为止,已在核糖核酸(RNA)中发现了170多种不同的化学修饰,这些修饰分布在各种类型的RNA中,包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和小核RNA(snRNA)等。RNA修饰在广泛的生物过程中发挥着至关重要的作用,如调节基因表达、维持RNA稳定性和促进蛋白质翻译等。RNA修饰构成了基因表达调控的新层面,即“表观转录组”。RNA修饰以及相关修饰酶(writer)、去修饰酶(eraser)和修饰识别蛋白(reader)的发现,为研究RNA修饰的动态调控及生理功能提供了重要依据。随着RNA修饰检测技术的发展,RNA表观转录组学研究进入了单碱基分辨率、多层面、全覆盖的发展阶段。这些覆盖全转录组的分析方法有助于发现新的RNA修饰位点,对于阐明表观转录组学的分子调控机制、探索RNA修饰的疾病关联及临床应用具有重要意义。根据处理方式及测序原理的差异,现有的RNA修饰测序技术可以分为直接高通量测序、抗体富集测序、酶辅助测序、化学辅助测序、代谢标记测序和纳米孔测序。这些方法伴随着RNA修饰功能的研究大大拓展了人们对表观转录组学的认识。在这篇综述中,我们总结了近年来有关RNA修饰检测技术的进展,重点聚焦于不同方法的基本原理、优势和局限性。针对不同类型的RNA修饰,探讨测序分析方法,对未来新型RNA修饰定位技术的开发具有指导意义,有助于在全转录组范围内研究RNA修饰的功能。

关键词：表观转录组学核糖核酸修饰定位分析高通量测序单碱基分辨率

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脱氨酶介导的DNA中胞嘧啶修饰定位分析

脱氨酶介导的DNA中胞嘧啶修饰定位分析

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作者：李俏莹武汉大学

学位级别：硕士

人类基因组计划的完成,标志着基因组测序研究在生命科学领域中越来越重要,挖掘功能基因的作用,揭示基因与疾病之间的联系。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)是DNA甲基化中最常见的一种,在哺乳动物中,大约占胞嘧啶总量的3-8%[1]。在t... 详细信息

人类基因组计划的完成,标志着基因组测序研究在生命科学领域中越来越重要,挖掘功能基因的作用,揭示基因与疾病之间的联系。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)是DNA甲基化中最常见的一种,在哺乳动物中,大约占胞嘧啶总量的3-8%[1]。在ten-eleven translocation(Tet)蛋白的作用下,5-甲基胞嘧啶会被逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine,5f C)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine,5ca C)。为了深入了解每一个胞嘧啶甲基化修饰的生物学功能和意义,在全基因组上对胞嘧啶修饰的分布进行分析非常必要。这些修饰具有表观遗传调控的重要功能,为了深入研究这些修饰的生物学功能,需要精准的阐明其在基因组上的确切位置,获得它们的单碱基分辨率的定位信息。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样基因(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide-like,简称APOBEC)家族蛋白具有胞嘧啶的脱氨活性,近年来研究发现APOBEC3A蛋白除了能够对DNA上的C和5m C进行脱氨基外,对于5m C的氧化衍生物产物也具有一定的脱氨基活性。基于此,我们利用APOBEC3A蛋白的脱氨基活性,研究了APOBEC3A蛋白对C、5m C、5hm C、5f C和5ca C的脱氨活性,分别建立了DNA中5hm C和5ca C单碱基分辨率定位分析方法。具体内容如下:1、脱氨酶介导5hm C单碱基定位分析重组表达了APOBEC3A蛋白,利用限制性内切酶方法和高效液相色谱串联质谱鉴定APOBEC3A蛋白的活性。APOBEC3A可以轻易地对C、5m C和5hm C进行脱氨基,使其转化为相应的尿嘧啶(uracil,U)、胸腺嘧啶(thymine,T)和5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil,5hm U)。为了要检测DNA上的5hm C,我们利用T4噬菌体β葡糖基转移酶对DNA上5hm C进行标记,标记后的5hm C可以很好的抵御APOBEC3A的脱氨基作用。经过PCR扩增后,在测序过程中,原来的DNA模板上的C和5m C被读作T,而被保护的5hm C被读作C。结合二代测序可以得到基因组DNA上5hm C单碱基定位信息。2、脱氨酶介导5ca C单碱基定位分析方法通过酶促反应动力学考察了APOBEC3A蛋白对C、5m C、5hm C、5f C和5ca C的反应速率研究APOBEC3A对C、5m C、5hm C、5f C以及5ca C的脱氨基活性后,我们发现,APOBEC3A对5ca C几乎没有任何的脱氨活性,基于此,我们直接利用APOBEC3A对DNA进行处理,C、5m C、5hm C和5f C都会被APOBEC3A蛋白脱氨基形成相应的脱氨产物,经过PCR扩增后,在测序过程中,C、5m C、5hm C以及5f C都被读作成T,只有5ca C被读作为C。通过对基因组DNA中5ca C的富集,再结合二代测序就可以快速简便的获得5ca C的单碱基定位信息。总的来说,本论文利用APOBEC3A蛋白对不同胞嘧啶修饰的活性,分别建立了针对5hm C和5ca C的单碱基定位分析方法,研究工作为深入探索5hm C和5ca C的生理功能提供了基础。

关键词： DNA甲基化 5-羟甲基胞嘧啶 5-羧基胞嘧啶单碱基分辨率脱氨酶测序质谱分析

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脱氨酶介导的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定位分析及5-羟甲基胞嘧啶在肺癌发生与发展过程中的变化规律研究

脱氨酶介导的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定位分析及5-羟甲基胞嘧啶在...

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第十一届全国化学生物学学术会议

作者：谢能彬李俏颖袁必锋冯钰锜生物医学分析化学教育部重点实验室武汉大学化学与分子科学学院

5-甲基胞嘧啶是一种常见的DNA甲基化修饰,该修饰对多种生物学过程有至关重要的调控作用。5-甲基胞嘧啶在Tet蛋白的催化作用下可以被逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶及5-羧基胞嘧啶。[1]近年来的研究表明,5-羟甲基胞嘧啶参与了... 详细信息

5-甲基胞嘧啶是一种常见的DNA甲基化修饰,该修饰对多种生物学过程有至关重要的调控作用。5-甲基胞嘧啶在Tet蛋白的催化作用下可以被逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶及5-羧基胞嘧啶。[1]近年来的研究表明,5-羟甲基胞嘧啶参与了基因表达的调控、细胞分化等多个生物学过程,并与癌症的发生及发展有着重要的联系,是一种新的癌症生物标志物。[2]因此,5-羟甲基胞嘧啶的相关研究对基因表达调控的探索、细胞分化的研究、癌症的诊断及治疗等有着重要的促进作用。为深入研究5-羟甲基胞嘧啶的生物学功能,我们建立了脱氨酶介导的5-羟甲基胞嘧啶单碱基水平测序方法。该方法利用T4噬菌体β糖基转移酶来保护5-羟甲基胞嘧啶,使其能够抵抗脱氨酶（APOBEC3A）的脱氨基作用。经过脱氨酶处理和PCR扩增后,DNA中的未被修饰的胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶会被读作胸腺嘧啶,而5-羟甲基胞嘧啶仍会被读作胞嘧啶,进而实现了5-羟甲基胞嘧啶的单碱基水平测序。[3]为了研究5-羟甲基胞嘧啶在肺癌的发生与发展中的作用,我们利用该方法进一步探索了肺癌病人组织中的5-羟甲基胞嘧啶的分布变化规律。

关键词： 5-羟甲基胞嘧啶单碱基分辨率测序方法肺癌

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