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牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

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牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用

作者：王单晶华中农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)于1955年在美国首次发现。而Madin等人在第二年从病牛身上分离到牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis viruse, IBRV)。1964年牛鼻气管炎病毒被Huck确认属于疱疹病毒,该病毒又称牛1型疱疹病毒(Bovine herpesvirus-1,BHV-1),是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的成员,它是一种有囊膜的双股DNA病毒。牛传染性鼻气管炎是一种牛呼吸道接触性传染病,会引起鼻气管炎、生殖道炎及母牛流产等。虽然牛传染性鼻气管炎不会造成很高的死亡率,但是感染该病毒后会造成潜伏感染和终生感染,当机体的抵抗力降低时,病毒被重新激活,向体外排毒,使得该病极难根治,由此给养牛业带来很大影响。该病从发现至今几乎所有的国家均检出IBR阳性,目前仅在澳大利亚、丹麦、芬兰、挪威、瑞典、瑞士根除了该病。我国最早是于20世纪70年代在进口牛群中发现该病,之后一直在各地均检出该病感染牛群。近几年该病的流行病学调查发现,我国牛群IBR平均感染率达到40%左右,而该病的防治措施主要是疫苗接种和病牛扑杀,所以建立有效的牛传染性鼻气管炎检测方法十分必要。因此,本研究筛选出针对牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体,制备了辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体,在此基础上建立了牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法,并将该方法用于牛传染性鼻气管炎流行病学调查中。主要工作包括：1.牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备以灭活的纯化IBR病毒粒子作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,五免后取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,以间接ELISA方法筛选阳性融合细胞,经过有限稀释法克隆3次,获得2株能稳定分泌抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1H3、3G9。杂交瘤细胞株扩大培养后接种Balb/c小鼠,收获的2株腹水效价均达到1：100×27,将单克隆抗体与病毒粒子进行免疫沉淀,所得免疫沉淀物进行质谱鉴定,发现这2株单抗1H3、3G9分别针对IBRV的囊膜糖蛋白gB、gC。2.牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法的建立将纯化的IBR病毒粒子灭活后,包被于96孔酶标板,采用改良过碘酸钠法将筛选的单克隆抗体1H3株标记HRP,在此基础上建立牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法。经方阵ELISA方法确定抗原包被浓度为4μg/mL,被检血清稀释度为1：5,酶标单克隆抗体稀释度为1：800。选取经美国IDEXX传染性牛鼻气管炎病毒gE抗体检测试剂盒检测为阳性的血清103份、检测为阴性血清62份,采用本研究建立的阻断ELISA方法检测以上已知背景血清,结果显示阳性符合率为96.12%,阴性符合率为100%,总符合率为97.57%。同时采用本方法检测了牛5型疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、羊布鲁氏菌、伪狂犬病毒、戊型肝炎病毒的阳性血清,结果显示该方法除与牛5型疱疹病毒的阳性血清有交叉反应外,其余均无交叉反应。以上结果表明本研究所建立的IBRV抗体检测阻断ELISA方法有很好的敏感性和特异性。3.牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法的临床应用采用IBRV抗体检测阻断ELISA方法对西藏、青海、四川的1668份牛血清进行了检测,结果显示西藏、青海、四川IBRV阳性率分别为40.44%、49.56%、32.63%,平均阳性率为40.52%。

关键词：牛传染性鼻气管炎单抗隆抗体辣根过氧化物酶阻断ELISA 流行病学调查

课题1、抗CMV pp65抗原单克隆抗体的制备、抗原血症检测的方法学建立及临床比对试验课题2、北京地区低危人群梅毒血清学筛查模式改进

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课题1、抗CMV pp65抗原单克隆抗体的制备、抗原血症检测的方法学...

作者：陈兰兰北京协和医学院

学位级别：硕士

[研究背景1人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV/CMV)是人体常见的隐性感染病毒之一,在人群中的血清阳性率较高,虽然对于免疫功能正常的人体一般不会引起严重的临床后果。但是,当机体免疫功能因疾病进展或医源性因素受到损伤或抑制... 详细信息

[研究背景1人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV/CMV)是人体常见的隐性感染病毒之一,在人群中的血清阳性率较高,虽然对于免疫功能正常的人体一般不会引起严重的临床后果。但是,当机体免疫功能因疾病进展或医源性因素受到损伤或抑制时,长期潜伏于患者体内CMV转为激活感染,引起严重的临床后果。CMV pp65抗原蛋白(巨细胞病毒低基质磷蛋白)是CMV UL83基因编码、分子量约65KD的被膜蛋白,是巨细胞病毒活动性复制时产量最多的病毒蛋白,也是目前公认的CMV活动性感染早期、快速诊断指标。但是,目前国内CMV pp65抗原检测试剂盒几乎均为国外进口,价格昂贵。中国市场尚无国产的CMV pp65抗原血症检测试剂盒。[研究目的]本研究的主要目的是利用巨细胞病毒抗原制备抗CMV pp65抗原的单克隆抗体,并以自制单抗隆抗体为基础建立检测外周血CMV pp65抗原血症的实验方法,为国产试剂盒的研发奠定基础。[研究方法]CMV AD169株接种人胚胎肺成纤维细胞MRC-5细胞,得到不同感染时间(24h、48h和72h)的病毒包涵体,超声波破碎和甲醛灭活法制备巨细胞病毒抗原,与商业购买的巨细胞病毒pp65重组抗原分别免疫BALB/C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。然后利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒CMV Brite进行比对,应用SPSS17.0统计软件分析两种方法的一致性。[研究结果]1.经筛选共得到两株抗CMV pp65抗原的杂交瘤细胞株,克隆株名称分别为29F1-1和13D1-3。按照小鼠免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒说明书进行亚型鉴定,13D1-3克隆株分泌的单抗为IgG1型,29F1-1单抗为IgG2a型。抗体特异性好,与HSV-1、HSV-2、MRC-5、BGMK、VZV均无交叉反应。两株杂交瘤细胞诱导的小鼠腹水含大量单克隆抗体,13D1-3抗体滴度1：5000,29F1-1抗体滴度达1：2000。经ProteinG亲和层析法纯化后仍具有良好的免疫学特性。2.以3.7%甲醛浓度固定外周血白细胞,0.5%IGEPAL CA-630透化处理,0.5%BSA0.01M PBS封闭,13D1-3单克隆抗体作为第一抗体,FITC标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体建立外周血CMV pp65抗原血症检测方法。本实验室自建方法与CMV BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率=88.8%,阴性符合率=98.9%,总符合率=97.3%, kappa值=0.895,吻合度较高。[研究结论]成功制备了抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,并建立以13D1-3单克隆抗体为基础的检测外周血CMVpp65抗原血症的方法,与CMV Brite试剂盒比对具有良好的符合性,可进一步临床应用研究。[研究背景]梅毒(Syphilis)是由苍白密螺旋体(Treponema pallidum)感染的性传播疾病(sexually transmitted diseases, STD),也可通过血液或伤口传播。目前梅毒仍然是世界上重要的公众健康问题,全球每年新增梅毒感染病例将近1200万。美国CDC推荐的以梅毒螺旋体非特异性抗体试验为初筛试验的传统筛查方案(Traditional screening algorithm),由于传统方案诊断梅毒漏诊率高,敏感性低已逐渐被淘汰。国外一些实验室逐渐采用梅毒血清学逆向筛查方案(reverse screening algorithm),既首先使用梅毒螺旋体特异性抗体试验进行初筛,阳性标本再使用梅毒螺旋体非特异性抗体试验评估活动性,但推荐这种模式的国家和地区其筛查对象主要是孕妇或其他有危险性行为的人群。而在中国,由于特殊的医疗环境,进行梅毒血清学筛查的人群除了孕妇、高危性行为人群外,所有进行侵入性或有创性医疗诊治的患者都要进行梅毒血清学筛查,因此,西方国家建议的逆向筛查模式可能不适于中国人群,尤其是在一些大型综合性医院就诊的低危人群患者。[研究目的]通过分析梅毒血清学逆向筛查模式,查找该模式存在的问题,并在其基础上进行改进,提出适用于中国地区低危人群的梅毒血清学筛查模式。[研究方法]雅培公司化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)对来协和医院就诊的患者进行梅毒血清学初筛,阳性标本进行梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)复检并同时行梅毒快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)。CMIA初筛与TPPA复检不符的标本进行荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)验证。[研究结果]2013年8月份至2014年1月份在北京协和医院共有4127

关键词：巨细胞病毒单抗隆抗体 CMV pp65抗原血症梅毒筛查化学发光微粒子免疫分析试验梅毒螺旋体乳胶颗粒凝集试验

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氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

中国兽药杂志 2010年第10期44卷 29-33页

作者：刘艳霞谭建华金宇保灵生物药品有限公司呼和浩特010030 军事医学科学院11所长春130062

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板... 详细信息

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。

关键词：氟罗沙星单抗隆抗体

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Avastin在眼科的应用研究进展

眼科新进展 2009年第3期29卷 231-233页

作者：冯斐赵培泉江苏省泰兴市人民医院眼科 225400 上海交通大学医学院附属新华医院上海市200092

抗癌新药Bevacizumab(商品名Avastin)是一种重组人类单克隆抗体,2004年2月26日获美国食品和药品管理局批准上市,用于一线治疗晚期结直肠癌。近年来Avastin在临床治疗年龄相关性黄斑变性、黄斑囊样水肿以及糖尿病视网膜病变等新生血管性... 详细信息

抗癌新药Bevacizumab(商品名Avastin)是一种重组人类单克隆抗体,2004年2月26日获美国食品和药品管理局批准上市,用于一线治疗晚期结直肠癌。近年来Avastin在临床治疗年龄相关性黄斑变性、黄斑囊样水肿以及糖尿病视网膜病变等新生血管性眼病方面效果明显,但还需大样本的进一步临床治疗研究。本文就Avastin在眼科的应用研究进展作一综述。

关键词：血管内皮生长因子单抗隆抗体 Avastin

氨甲喋呤-人血清白蛋白-单抗79结合物的制备及其体外细胞毒作用

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生物化学杂志 1991年第5期7卷 602-607页

作者：刘晓坤殷惠君沈倍奋空军总医院血液科北京100036 军事医学科学院基础医学研究所

本研究采用间接连接法,应用异型双功能连接剂SPDP,形成以酰胺键和二硫键连接的氮甲喋吟-人血清白蛋白-单抗79(MTX-HSA-McAb79)结合物。其中McAb79与HSA克分子比有效地控制在1:1～2,且结合物的纯度及产率均较高,有一定的制备价值。对靶... 详细信息

本研究采用间接连接法,应用异型双功能连接剂SPDP,形成以酰胺键和二硫键连接的氮甲喋吟-人血清白蛋白-单抗79(MTX-HSA-McAb79)结合物。其中McAb79与HSA克分子比有效地控制在1:1～2,且结合物的纯度及产率均较高,有一定的制备价值。对靶细胞Nalm-6的体外细胞毒试验结果表明:MTX-HSA-McAb 79的杀伤活性显著强于MTX-HSA-nIgG,但较游离MTX的杀伤活性为弱。且MTX-HSA-McAb 79的杀伤作用依赖于McAb 79与靶抗原CALLA的抗原抗体反应。

关键词：单克隆抗体血清白蛋白单抗隆抗体

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氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定