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单分子荧光共振能量转移数据处理的优化算法

物理学报 2017年第11期66卷 339-346页

作者：吕袭明李辉尤菁李伟王鹏业李明奚绪光窦硕星中国科学院物理研究所软物质物理重点实验室北京凝聚态物理国家实验室北京100190 中国科学院大学物理科学学院北京100049 西北农林科技大学生命科学院杨凌712100

单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术是当今单分子生物物理研究领域的重要实验手段,该技术通过测量供体、受体荧光光强以及二者间的共振能量转移效率,揭示标记位点间的距离,用于研究DNA、蛋白质等生物大分子的构象变化.然而,当前传统数... 详细信息

单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术是当今单分子生物物理研究领域的重要实验手段,该技术通过测量供体、受体荧光光强以及二者间的共振能量转移效率,揭示标记位点间的距离,用于研究DNA、蛋白质等生物大分子的构象变化.然而,当前传统数据处理方法大量依赖人工干预,噪音大,严重影响了实验效率和数据的可靠性.本文提出了一种针对smFRET数据的自动分析算法.该算法主要包括三个部分:基于计算供体与受体荧光光强的相关系数来确定受体与供体对应荧光点的自动匹配算法、甄别错误点的筛选算法以及基于隐马尔可夫模型的全局拟合算法.经改进后的算法大大简化了传统算法中需要人工干预的步骤,而且自动筛除了实验数据中主要的几类噪音.将改进的算法应用于人类端粒重复序列G-四联体(G4)DNA折叠动力学的数据分析,结果显示优化算法比传统算法能够更快地得到更高信噪比的数据,而且该数据结果清晰地表明G4的折叠体现出多态性并受到钾离子浓度的影响.

关键词：单分子荧光共振能量转移数据处理算法 G-四联体DNA 折叠动力学

单分子荧光共振能量转移技术在核糖体移位研究中的进展

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生物化学与生物物理进展 2018年第3期45卷 314-324页

作者：徐本锦宋广涛秦燕中国科学院核酸生物学重点实验室中国科学院生物大分子卓越中心中国科学院生物物理研究所北京100101 中国科学院大学北京100049 山西医科大学汾阳学院医学检验系汾阳032200

核糖体是蛋白质的"合成工厂",也是临床上多种抗菌药物的作用靶点,因此,深入理解细菌核糖体的蛋白质翻译机制意义重大.蛋白质翻译是通过多步骤相互协调、多组分精细配合来实现高保真和精确调控.核糖体在mRNA上的移位作为翻译过程中最重... 详细信息

核糖体是蛋白质的"合成工厂",也是临床上多种抗菌药物的作用靶点,因此,深入理解细菌核糖体的蛋白质翻译机制意义重大.蛋白质翻译是通过多步骤相互协调、多组分精细配合来实现高保真和精确调控.核糖体在mRNA上的移位作为翻译过程中最重要的事件之一,需要核糖体大规模的构象重排以及tRNA2-mRNA沿着核糖体的精确移动.在细菌中,移位是由延伸因子EF-G催化GTP水解来驱动的.近年来,单分子荧光共振能量技术(smFRET)的发展使得人们可以探究单个tRNA分子移位的动力学过程并实时观测核糖体的构象变化.本文首先介绍了smFRET技术的原理及特点,对其在核糖体结构动态及tRNA移位研究中的应用进行了较为系统的总结,并对其应用前景进行了展望.

关键词：核糖体移位 tRNA 单分子荧光共振能量转移

单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究

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单分子水平上的荧光共振能量转移及漂白行为的研究

作者：刘新亮湖南大学

学位级别：硕士

单分子检测(SMD,Single Molecule Detection)正在生物学、物理学、医学、化学以及纳米材料等前沿领域得到广泛的应用和迅猛的发展。SMD能够检测复杂体系中的个体,尤其是可以研究反应中的中间产物,实时观测反应过程。其中单分子荧光成像... 详细信息

单分子检测(SMD,Single Molecule Detection)正在生物学、物理学、医学、化学以及纳米材料等前沿领域得到广泛的应用和迅猛的发展。SMD能够检测复杂体系中的个体,尤其是可以研究反应中的中间产物,实时观测反应过程。其中单分子荧光成像技术成为了研究单分子相互作用、单分子动力学过程和生物大分子构象转变的重要工具。利用单分子荧光光谱可以区分复杂的生物体系中被不同的荧光基团标记的生物大分子。本论文对单分子对荧光共振能量转移(spFRET,single pair Fluorescence Resonance Energy Transfer)的研究就是利用单分子荧光光谱实现了单通道内检测分子之间的荧光共振能量转移。荧光染料通常被标记在生物大分子上,以对其进行定位和示踪。但是荧光漂白现象却是荧光染料广泛应用的一个巨大的障碍,所以如何抑制光漂白成为研究的重点,但是却鲜有研究单个荧光染料分子漂白前光强度的变化。本论文基于普通宽场落射式荧光显微镜观测了双标记的病毒的外壳和DNA;构建了一个单通道内观测spFRET的平台;探究了多种荧光染料分子的漂白行为。具体内容如下:1、单通道内观测spFRET。在电子耦合倍增管(EMCCD)芯片的前方添加一块透射光栅,利用透射光栅的分光作用,根据不同的荧光物质被光栅分光后零级点到一级条纹之间的距离不同的原理,用一块双通滤光片作为滤光块的发射滤光片只允许供受体发射光通过,供体被激发以后受体也发出荧光被最终呈现一个零级点和两条一级条纹。分别以Streptavidian-Alexa594、Atto488-biotin和Cy3、Cy5为研究对象,实现了单通道内检测单对荧光共振能量转移。2、单个荧光染料漂白行为的研究。对罗丹明B、Alexa fluor、YOYO-1染料在荧光漂白前荧光强度的变化进行分析,得出这几种荧光染料分子在荧光漂白前的强度变化是一个随时间变化的线性函数,并且这个函数的斜率服从洛伦兹分布。考察了不同极性溶剂和不同pH值溶剂对其荧光强度变化的影响。并且发现长波长光对荧光染料分子同样具有光漂白作用。3、病毒外壳和DNA链的双标记。先将一种荧光染料标记在腺病毒的外壳上,病毒裂解后,用嵌入式荧光染料(YOYO-1)标记病毒释放的DNA。实现普通宽场显微镜下观测单个病毒及其裂解产生的核酸,为将来在微流控通道中和细胞内动态观测病毒释放DNA的过程打下了基础。

关键词：单分子单分子荧光共振能量转移光漂白单个病毒

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解旋酶Sen1行走机制的研究

物理学报 2023年第10期72卷 354-362页

作者：张悦悦韩伟静陈同生王爽华南师范大学生物光子学研究院广州510631 松山湖材料实验室东莞523808 中国科学院物理研究所北京100190

转录终止是调节基因转录过程的重要步骤,关系到基因表达调控过程的正常进行和基因组的稳定性.酵母体系中,Sen1是一种解旋酶,通过水解腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)获得能量来行使在核酸底物上的一维运动,进而实现转录终止功能... 详细信息

转录终止是调节基因转录过程的重要步骤,关系到基因表达调控过程的正常进行和基因组的稳定性.酵母体系中,Sen1是一种解旋酶,通过水解腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)获得能量来行使在核酸底物上的一维运动,进而实现转录终止功能.然而,Sen1的这种运动机制与转录终止功能的关联,目前尚未清晰的表征.本文应用凝胶电泳迁移方法表征Sen1解旋双链DNA和结合单链DNA的能力,并且发现单个Sen1分子能够结合≤24 nt(nucleotide,nt)的单链DNA;进一步,在提供ATP的条件下,应用单分子荧光共振能量转移技术表征了Sen1在单链DNA上的行走功能,其行走速率随ATP浓度变化而变化,符合经典米氏动力学模型;考虑单链DNA底物的长度,可以估算出Sen1的行走速率约为70 nt/s.这些研究结果定量表征了Sen1的行走速率,为理解真核转录终止机制提供了分子马达运动方面的实验数据.

关键词： Sen1解旋酶行走单分子荧光共振能量转移转录终止

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单分子技术的i基序DNA动态结构实验研究

实验室研究与探索 2023年第10期42卷 19-21,88页

作者：顾江新侯锡苗西北农林科技大学资源环境学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

为探索i基序(i-motif)DNA结构的折叠过程,利用单分子荧光共振能量转移技术,对基因序列bcl2在不同pH值(6.2~8.0)条件下进行动态检测。结果表明:当pH=6.2时,bcl2序列的荧光传递效率分布在0.95处为单峰,即i-motif结构处于均匀、完全的折叠... 详细信息

为探索i基序(i-motif)DNA结构的折叠过程,利用单分子荧光共振能量转移技术,对基因序列bcl2在不同pH值(6.2~8.0)条件下进行动态检测。结果表明:当pH=6.2时,bcl2序列的荧光传递效率分布在0.95处为单峰,即i-motif结构处于均匀、完全的折叠状态;随着pH值增加至8.0,荧光传递效率分布逐步向左移动,效率峰最终停留在0.40处,即i-motif结构在高pH值条件下的部分去折叠过程。荧光能量转移效率动态分布曲线拟合出6个峰,即i-motif结构具有6个折叠状态。证明了当pH值发生改变时,i-motif可以在多种折叠状态间进行自发地变构与转换,为进一步研究i-motif的生理功能提供参考。

关键词：单分子荧光共振能量转移生物大分子 i基序动态结构

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单分子技术研究T7解旋酶的解旋与换链

物理学报 2018年第11期67卷 252-262页

作者：陈泽马建兵黄星榞贾棋徐春华张慧东陆颖陆军军医大学军事预防医学院毒理学研究所重庆400038 中国科学院物理研究所北京凝聚态物理国家研究中心北京100190 中国科学院大学物理科学学院北京100049

单分子荧光共振能量转移(smFRET)和磁镊(MT)技术目前广泛应用于研究分子马达.相较于常规技术,其具有高精度及动态观测的优点.本文研究对象为T7解旋酶,是六聚体解旋酶的典型代表.研究表明,这种解旋酶主要消耗脱氧胸苷三磷酸(dTTP)提供能... 详细信息

单分子荧光共振能量转移(smFRET)和磁镊(MT)技术目前广泛应用于研究分子马达.相较于常规技术,其具有高精度及动态观测的优点.本文研究对象为T7解旋酶,是六聚体解旋酶的典型代表.研究表明,这种解旋酶主要消耗脱氧胸苷三磷酸(dTTP)提供能量,且仅能沿着5′-3′单向进行行走和解旋工作.目前对于六聚体解旋酶的解旋和换链机制的认知仍然存在着诸多问题,因此本文主要以此作为切入点开展研究.首先通过运用smFRET技术研究T7解旋酶在不同DNA底物上的解旋现象,发现其需要3′-尾链参与到解旋工作中,但其为单链或双链结构并无明显区别;通过改变脱氧核糖核酸(DNA)序列中的GC含量,发现T7解旋酶随着序列中GC含量的升高会更容易在解旋过程中发生回退现象,导致解旋长度明显缩短;通过进一步分析发生回退先的实验数据,发现T7解旋酶除了可以瞬时回退到叉形DNA岔口或脱落外,还可以缓慢回退到叉形DNA岔口;运用MT技术研究该解旋酶,同样发现这种缓慢回退现象的存在.根据T7解旋酶解旋DNA遵循的单向性和极性,其只能沿着5′到3′方向进行行走和解旋.因此,本文推测这种缓慢回退的现象可能是解旋酶从5′-链转移至3′-链上,即发生换链过程;最后,本文提出了T7解旋酶在解旋过程中进行换链的模型,将有助于进一步理解环状六聚体解旋酶行使其功能的分子机制.

关键词：单分子荧光共振能量转移磁镊 T7解旋酶换链

大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制

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南京农业大学学报 2017年第5期40卷 874-880页

作者：赵富林徐明飞谢青云单衍可雷静施志玉孙海凤刘斐南京农业大学动物医学院江苏南京210095

[目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末... 详细信息

[目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1Ded1p、2 mmol·L-1ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的sm FRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。

关键词：单分子荧光共振能量转移 DExH/D-box家族 Ded1p蛋白荧光标记RNA 局部双链打开

BsPif1解旋酶作用于G-四链体DNA的特异性位点研究

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BsPif1解旋酶作用于G-四链体DNA的特异性位点研究

作者：张倩西北农林科技大学

学位级别：硕士

解旋酶是一类以ATP依赖的方式来催化破坏DNA或RNA之间的氢键的分子马达蛋白,参与细胞内多种代谢过程。Pif1解旋酶是广泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成员,近年来关于Pif1解旋酶的研究成果逐渐增多,得到... 详细信息

解旋酶是一类以ATP依赖的方式来催化破坏DNA或RNA之间的氢键的分子马达蛋白,参与细胞内多种代谢过程。Pif1解旋酶是广泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成员,近年来关于Pif1解旋酶的研究成果逐渐增多,得到了很多结构方面的数据,为理解Pif1解旋酶的工作机理和生物学功能提供了很多依据。2016年本实验室Chen et al.发表来自物种Bacteroides spp的Pif1解旋酶的BsPif1-AMPPNP,BsPif1-ADP,BsPif1-ADP-AlF-ssDNA复合体三级晶体结构,建立了BsPif1-dsDNA复合体结构模型并提出BsPif1解旋dsDNA的工作机理。但是BsPif1作为一种特异性的G-四链体DNA(G4 DNA)解旋酶,它是如何解开G4 DNA,解旋G4 DNA的区域在何处,与G4 DNA相互作用的特异性位点有哪些,这些信息都是未知的。故我们对BsPif1继续进行深入研究,期望能够得到BsPif1与G4 DNA的复合体结构,深入研究BsPif1与G4 DNA之间的相互作用,找到BsPif1与G4 DNA相互作用的特异性位点,为理解Pif1解旋酶在细胞内发挥的生物学功能提供更多的数据支撑。首先通过原核表达及纯化得到纯度达到95%的BsPif1解旋酶,通过体外退火、Mono-Q离子交换层析方法纯化得到纯度较高且性质稳定的核酸底物,进而采用凝胶过滤层析、动态激光散射等方法,筛选到能够与BsPif1形成稳定的复合体的核酸底物,进行复合体结晶初筛实验。分别选择了5’端带尾链长度>6nt的两种G4 DNA(7T 3G4、6T TelG4)及一种dsDNA(7T11bp)尝试了复合体结晶筛选。在分别尝试了1152种结晶条件以后,目前还没有得到一个复合体晶体。因此本课题通过分子动力学模拟建立了BsPif1-G4 DNA复合体的三维结构,利用点突变实验分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性位点。此外,荧光各向异性(FA)、快速停留荧光共振能量转移(stopped-flow FRET)、单分子荧光共振能量转移(smFRET)等3种方法分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性氨基酸位点。最终得出以下结论:1.荧光各项异性分析位点突变对DNA结合活性的影响。结果表明,K92、R120、K121、K292、K341这5个位点对混合构型的TelG4 DNA的结合起到非常重要的作用,而R83、K87、K92、R120、K121、K292、K341这7个位点均对平行构型的3G4DNA以及dsDNA的结合起到非常重要的作用。2.快速停留荧光共振能量转移技术测定BsPif1突变体蛋白对G4 DNA和dsDNA的解旋活性,从解旋速率和解旋幅度这两个参数来分析位点突变的影响。结果表明,位于1B结构域的R83位点是特异性解旋G4 DNA的重要位点,其对dsDNA的解旋没有直接作用;而位于2B结构域的K341位点是特异性解旋dsDNA的重要位点,其对G4 DNA的解旋没有直接作用;K92、R120、K121、K292这4个位点是同时参与解旋G4 DNA和dsDNA的重要位点,其中R120的突变对G4 DNA的解旋产生较大影响。3.单分子荧光共振能量转移技术进一步分析BsPif1位点突变对解旋G4 DNA的活性的影响,结果表明R83、K92、R120、K121、K292这5个位点参与G4 DNA的解旋,与stopped-flow FRET分析得出的结论一致。最终发现位于1B结构域的R83是特异性地参与G4 DNA解旋的位点,其对dsDNA的解旋没有影响,并且位于1A结构域的R120位点对G4 DNA的解旋有重要作用。同时点突变实验结果也证明运用分子动力学手段建立的BsPif1-G4 DNA复合体结构模型对理解BsPif1与G4 DNA相互作用提供了重要的参考价值,这将会对后续指导我们研究BsPif1解旋酶的机理有很大的价值。

关键词： BsPif1解旋酶蛋白质表达纯化荧光各向异性快速停留荧光检测单分子荧光共振能量转移

PGK和打结蛋白YibK、YbeA的表达、纯化及折叠机理的研究

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PGK和打结蛋白YibK、YbeA的表达、纯化及折叠机理的研究

作者：孙茜中国石油大学（华东）

学位级别：硕士

近几年，越来越多的打结蛋白被发现，但是究竟这类蛋白石如何打结的仍然不清楚。通常情况下多肽链能够自己打结被认为不可能，因此这类蛋白的出现带来了一类新的蛋白折叠问题。YibK和YbeA蛋白都是一类甲基转移酶，这个家族的蛋白在它的... 详细信息

近几年，越来越多的打结蛋白被发现，但是究竟这类蛋白石如何打结的仍然不清楚。通常情况下多肽链能够自己打结被认为不可能，因此这类蛋白的出现带来了一类新的蛋白折叠问题。YibK和YbeA蛋白都是一类甲基转移酶，这个家族的蛋白在它的多肽链上都含有一个三叶结的打结结构。同时YibK和YbeA的打结结构相对一些复杂的打结结构来说比较简单，同时它们的分子量适中，是比较理想的研究对象。我们对蛋白做了一系列的表征，通过荧光和CD对其化学稳定性做了检测，并且通过CD探讨了其热稳定性情况，与此同时，我们对蛋白做了荧光标记，选择荧光染料AF488和AF647将其标记在蛋白的半胱氨酸上，构建能量转移体系，对其做了单分子的检测。 PGK（磷酸甘油酸激酶，Phosphoglycerate kinase）是糖酵解的关键酶，也是每种生物得以生存的必须酶，该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱。它主要由两个球形的结构阈构成，在与底物结合的过程中发生显著的构象改变，最终发生催化效应。PGK结构、折叠与功能的研究对揭示蛋白质的折叠机理以及PGK蛋白的作用机制有着重要的意义。在本课题中，我们建立了PGK在大肠杆菌中高效表达的方法，并通过纯化得到了纯度和产率较高的PGK。然后对得到的PGK进行了一系列的表征，包括：（1）用圆二色光谱仪对PGK的二级结构进行了分析，结果表明其二级结构为典型的α螺旋，这和报道中的结果相一致;（2）在圆二色光谱仪上分别测定了存在Al3+和不存在Al3+情况下的PGK的热变性曲线;（3）我们用荧光染料AF488和AF647对蛋白进行了荧光标记并且通过单分子检测对其折叠过程进行了研究。

关键词：打结蛋白 YibK YbeA 单分子荧光共振能量转移 PGK 铝离子