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昆虫多结构域几丁质酶ChtⅡ中CBM结构域的功能研究

昆虫多结构域几丁质酶ChtⅡ中CBM结构域的功能研究

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作者：郭小溪大连理工大学

学位级别：硕士

几丁质是一种多糖类物质,在自然界中含量仅次于纤维素。其水解产物和衍生物可用于许多领域。自然界中几丁质多以结晶态形式存在,难于降解。常用的化学方法降解容易带来污染,酶法降解是环境友好的重要手段。认识并发掘对几丁质,尤其是结... 详细信息

几丁质是一种多糖类物质,在自然界中含量仅次于纤维素。其水解产物和衍生物可用于许多领域。自然界中几丁质多以结晶态形式存在,难于降解。常用的化学方法降解容易带来污染,酶法降解是环境友好的重要手段。认识并发掘对几丁质,尤其是结晶态几丁质具有高活性的几丁质降解酶,是几丁质资源利用需要解决的关键问题。几丁质是昆虫的重要组成成分,昆虫体内存在着完整的几丁质降解酶系统,以完成正常生长发育所需的几丁质的周期性更新。在昆虫的几丁质降解体系中,ChtⅡ对昆虫生长发育十分重要,分子量大且结构复杂,有多个结构域。其复杂的结构域组成在昆虫所属的GH18家族糖基水解酶中非常少见。前期研究工作中发现几丁质结合结构域(Chitin-binding modules,CBM)能够提高几丁质酶的催化活性。然而,CBM在ChtⅡ水解几丁质的过程中所起到作用的具体机制尚不清楚。本文以来自于亚洲玉米螟的几丁质酶OfChtⅡ为研究对象,主要完成了以下工作:(1)利用毕赤酵母表达系统,成功表达纯化获得了OfChtⅡ三种具有不同数目结合结构域的截短体OfChtⅡ-B4C1、OfChtⅡ-B6C1以及OfChtⅡ-C1。(2)以两种形态不同的β-几丁质为底物测定并比较了酶不同截短体的水解活性和结合能力。发现随着CBM数目的增加,截短体OfChtⅡChtⅡ-B4C1、OfChtⅡ-B6C1以及OfChtⅡ-C1的水解能力随之增强,结合能力也随之增强。此外,CBM的存在对于致密底物的结合能力影响更为显著,有助于其水解。(3)通过电镜技术观测了酶水解后底物形貌的变化。OfChtⅡ能够破坏几丁质致密的结构,通过水解作用使其变得松散,产生短纤维。在此过程中,CBM的增加有助于提高ChtⅡ作用的效果,帮助催化域产生松散的几丁质。(4)使用高速原子力显微镜,对几丁质酶截短体水解底物的过程进行单分子分析。在结晶程度低的底物上,随着CBM的增加,结合能力k随之增加,促进水解,而在结晶程度高的底物上,多个CBM才能够显著影响k。此外,证明了OfChtⅡ具有内切几丁质酶的性质,解释了电镜中所观察到的细小松散的几丁质出现的原因。(5)成功构建了LPMO-(GGGGS)-OfChtⅡ杂合酶并转入酵母感受态细胞中。本文的结果证明了几丁质结合结构域CBM在几丁质酶OfChtⅡ水解过程中的重要作用,讨论了其可能的作用机制,有助于揭示多结构域几丁质酶水解几丁质的机制,进一步指导高效几丁质酶的设计与改造,实现几丁质资源的高效利用。

关键词：几丁质几丁质酶ChtⅡ 几丁质结合结构域单分子水平分析

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