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基于单个b细胞抗体制备技术研制全犬源犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体

基于单个B细胞抗体制备技术研制全犬源犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体

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作者：穆永河南农业大学

学位级别：硕士

犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）是当前威胁犬科动物健康的重要病原体之一,该病具有较高的发病死亡率,各年龄阶段的犬均是感染对象。疫苗免疫是目前防控CDV感染的有效手段,由于免疫失败等原因造成CDV感染的犬,目前尚无用于该... 详细信息

犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）是当前威胁犬科动物健康的重要病原体之一,该病具有较高的发病死亡率,各年龄阶段的犬均是感染对象。疫苗免疫是目前防控CDV感染的有效手段,由于免疫失败等原因造成CDV感染的犬,目前尚无用于该病治疗的特效药。单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）特异性强、成分均一,作为抗体药物用于临床治疗时疗效显著,当前用于CDV辅助治疗的m Ab主要以鼠源单抗为主。鼠源单抗中的异源用于治疗时可能引起犬机体产生免疫排斥反应或过敏反应,随着人们对宠物犬健康更加关注,不含异源成分的全犬源单克隆抗体将是未来犬用抗体药物研发的主要方向。单个b细胞抗体制备技术是当前制备全人源或动物源单克隆抗体热门技术,目前该技术尚未在犬类上得到应用,因此本研究旨在利用单个b细胞抗体制备技术研制全犬源CDV单克隆抗体,为犬瘟热的治疗和研究提供新型基因工程抗体,以及为后续其他犬类病原体全犬源抗体药物的开发奠定基础。本研究主要包括以下几个方面:1、CDV H蛋白特异性记忆b细胞的分选与抗体基因的克隆用CDV弱毒苗对两只试验犬进行4次免疫,并对每次免疫后的血清抗体进行效价检测,选择体液免疫应答水平较高的犬分离外周血单个核细胞,并利用生物化H蛋白和荧光标记的犬CD分子单抗进行标记;通过流式细胞术分选抗原特异性单个记忆b细胞,利用单细胞RT-PCR技术扩增抗体重链和轻链可变区基因,最终从192个表型为CD3-/CD21+/CD27+/Ig G+/CDV H+的单个记忆b细胞中得到64条重链可变区序列（IGHV）、56条Lambda型轻链可变区序列（IGLV）及9条Kappa型轻链可变区序列（IGKV）,其中重轻链配对抗体37对。2、特异性记忆b细胞抗体可变区胚系基因多样性分析b细胞在分化发育过程中抗体基因会发生重排,形成高亲和力的b细胞抗原受体（b cell receptor,bCR）。本研究通过Ig bLASTH和IMGT/V-QUEST对测序得到的抗体重链和轻链可变区的多样性基因（Variable,V）、可变基因（Diversity,D）以及连接基因（Joining,J）的使用及重排情况,以及抗体可变区中互补决定区域（Complementarity determining region,CDR）的氨基酸分布规律进行分析,以此深入了解免疫犬bCR基因多样性形成机制。结果显示,在获得抗体基因中,IGHV胚系基因主要集中在IGHV3-38和IGHV3-19亚族,且IGHV3-38、IGHD2-1与IGHJ4-1的组合为优势重排;IGLV胚系基因多样性更加丰富,IGLV1-136亚族为优势亚族,而V-J重排却多发生在IGLV3-21与IGLJ3-1。IGHV-CDR3长度主要由8～17个氨基酸肽组成,而IGLV-CDR3长度集中在11个氨基酸肽。37对配对抗体可变区基因同源进化分析结果显示,抗体重链和轻链基因分别属于多个细胞亚群。3、全犬源单克隆抗体的表达与鉴定构建了17对重链和轻链配对抗体重组表达质粒,以重链和轻链质量比2:3共转染Exip CHO-S细胞进行抗体表达和纯化;通过Western-blot、SDS-PAGE对抗体表达及纯化情况进行鉴定,并通过ELISA、IFA以及病毒中和试验对m Ab生物学活性进行鉴定。结果显示,17株m Ab均成功表达,其中12株m Ab能被Protein A亲和层析树脂纯化;ELISA结果显示,表达17株m Ab中的10株能识别CDV H蛋白;IFA结果显示这10株CDV H蛋白m Ab均能识别转染H蛋白表达质粒的293细胞以及感染CDV的Vero细胞。综上所述,本研究首次建立了基于单个b细胞抗体制备技术制备全犬源单克隆抗体的技术平台,利用该技术平台筛选到10株CDV H蛋白特异性单克隆抗体,为后续CDV相关研究奠定了基础,也为全犬源抗体药物开发提供新方法。

关键词：犬 CDV H蛋白单个b细胞抗体制备技术全犬源单克隆抗体

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