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病原物协同致病性对棉花黄萎病严重度的影响

棉花学报 2018年第2期30卷 188-196页

作者：张帆李晓林张敬泽祝水金浙江大学农业与生物技术学院杭州310058

大丽轮枝菌是1种土传的维管束病原菌,由其引起的棉花黄萎病是我国棉花生产上最重要的病害之一。而最近发现了1种土壤习居的机会病原真菌棉帚霉菌能通过伤口侵入寄主,并与大丽轮枝菌协同加重棉花黄萎病严重度。棉帚霉菌能在营养非常贫乏... 详细信息

大丽轮枝菌是1种土传的维管束病原菌,由其引起的棉花黄萎病是我国棉花生产上最重要的病害之一。而最近发现了1种土壤习居的机会病原真菌棉帚霉菌能通过伤口侵入寄主,并与大丽轮枝菌协同加重棉花黄萎病严重度。棉帚霉菌能在营养非常贫乏的基质中产生分生孢子;超微结构观察也证实该病原菌在维管束组织中存在,并能产孢,显示了该真菌具有维管束病原菌的生物学特性。另外,土壤中的线虫活动可能使棉花根部产生伤口,也能促进病原菌的侵染。在总结分析生物学特性、侵染与互作机制等研究进展的基础上,提出建立棉花根围多病原物与寄主互作体系可深入研究棉帚霉菌与大丽轮枝菌协同致病机制的观点。

关键词：棉花大丽轮枝菌棉花黄萎病帚霉菌生物学特性协同致病性

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消化性溃疡相关致病因素协同致病性分析

中国老年学杂志 2010年第2期30卷 177-178页

作者：艾民长春大学特殊教育学院吉林长春130022

目的了解消化性溃疡患者相关致病因素(主要是服用NSAIDs与Hp感染)的协同致病作用。方法应用病例对照研究的方法对200例消化性溃疡患者及52例溃疡合并上消化道出血者及同一时期就诊的206例非胃十二指肠疾病患者进行NSAIDs服用情况的调查... 详细信息

目的了解消化性溃疡患者相关致病因素(主要是服用NSAIDs与Hp感染)的协同致病作用。方法应用病例对照研究的方法对200例消化性溃疡患者及52例溃疡合并上消化道出血者及同一时期就诊的206例非胃十二指肠疾病患者进行NSAIDs服用情况的调查和Hp感染的检测。结果服用NSAIDs合并Hp感染者患胃溃疡的OR值为19.11,明显高于单纯服用NSAIDs者(OR值5.93)和单纯Hp感染者(OR值5.74)患胃溃疡的OR值之和;服用NSAIDs合并Hp感染的胃溃疡发生上消化道出血的OR值为3.73,十二指肠溃疡患者发生上消化道出血的OR值为0.93,均低于单纯服用NSAIDs和单纯Hp感染的胃溃疡患者(OR值分别为3.9和0.56)和十二指肠溃疡患者(OR值分别为4.7和0.42)发生上消化道出血的OR值之和;与无溃疡未服NSAIDs者比较,间断服药者溃疡出血的OR值为3.99,短期服药者的OR值为2.89,长期服药者的OR值为3.39,三组比较无显著差异(P>0.05)。患十二指肠溃疡的老年患者为33/120(27.5%),与非老年组比较有非常显著性差异(P协同作用;在溃疡合并上消化道出血的发病中并无协同作用;溃疡合并上消化道出血与服用NSAIDs的时间长短无关;年龄因素在十二指肠溃疡的发病过程中发挥重要作用。

关键词：消化性溃疡致病因素协同致病性

禽呼肠孤病毒和血清4型Ⅰ群禽腺病毒共感染与协同致病性研究

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禽呼肠孤病毒和血清4型Ⅰ群禽腺病毒共感染与协同致病性研究

作者：闫阗山东农业大学

学位级别：硕士

禽病毒性关节炎(Avian viral arthritis)是由禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus,ARV)引起的一种以跗关节肿胀为特征的家禽传染病;心包积水肝炎综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)是由血清4型Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)引起的家禽致死性疾病。禽病毒性关节炎和HHS均是近年来严重阻碍家禽养殖业健康发展的重要传染病。2019年,本研究团队对8个商品肉鸡养殖场进行流行病学调查后发现,ARV的感染率约为73%,且ARV和FAdV-4混合感染率高达63%。为明确ARV和FAdV-4之间的协同致病性和可能涉及的共感染机制,开展了如下研究:1、ARV和FAdV-4对SPF鸡胚的共感染和协同致病性为解析ARV和FAdV-4对鸡胚的共感染和协同致病作用,本研究将120枚9日龄SPF鸡胚随机分为8个组(7个实验组,1个阴性对照组),分别进行了ARV和FAdV-4单独感染、同时感染及时序性感染的致病性研究。ARV和FAdV-4均经卵黄囊途径无菌接种SPF鸡胚,连续观察96 h并记录鸡胚死亡率,分别在24、48、72及96 hpi时,每组随机挑选3枚鸡胚,观察其病理变化并收集尿囊液检测病毒复制情况。实验结果显示,与单一病毒感染相比,ARV和FAdV-4共感染导致SPF鸡胚出现更严重的胚体出血和肝脏出血。ARV和FAdV-4单独感染组鸡胚死亡率分别为73%及47%,各共感染组鸡胚死亡率在87%00%之间,说明ARV和FAdV-4共感染增加了SPF鸡胚的死亡率。qPCR结果显示,在SPF鸡胚中,ARV可以促进FAdV-4的复制,而FAdV-4对ARV的复制无显著影响。2、ARV和FAdV-4对SPF鸡的共感染和协同致病性为明确ARV和FAdV-4对SPF鸡的共感染和协同致病作用,本研究将240只1日龄的SPF鸡随机分为8组,分别进行了ARV和FAdV-4单独感染、同时感染及时序性感染的致病性研究。ARV和FAdV-4分别经SPF鸡脚垫及腿部肌肉接种,连续观察14d,同时记录SPF鸡的临床症状和死亡率,并在6、12及24 hpi和2、4、7、10及14 dpi时,随机选取3只鸡,收集组织器官及血液进行病理组织学、病毒载量和细胞因子水平测定。结果表明,ARV和FAdV-4对SPF鸡呈现出较强的协同致病作用。ARV和FAdV-4共感染促进了HHS相关病症的发展,造成SPF鸡多脏器特别是免疫器官出现严重的组织学损伤。ARV和FAdV-4单独感染组SPF鸡的死亡率分别为11%及0%,各共感染组鸡的死亡率在14%0%之间,说明ARV和FAdV-4共感染导致SPF鸡的死亡率增高。共感染组SPF鸡肝脏中FAdV-4的DNA水平要高于FAdV-4单独感染组,肠道FAdV-4的病毒载量也要高于FAdV-4单独感染组。另外,细胞因子测定结果表明,ARV和FAdV-4共感染导致对SPF鸡先天免疫的抑制作用增强。3、ARV和FAdV-4共感染鸡胚肝细胞模型的建立为研究ARV和FAdV-4在鸡胚肝细胞中的共感染特点,本研究构建了鸡胚肝细胞模型,分别用1 MOI ARV和FAdV-4单独感染、同时感染及时序性感染鸡胚肝细胞。检测48 hpi的ARV和FAdV-4病毒载量,结果显示,同时感染组及时序性感染组中FAdV-4的病毒载量均要高于FAdV-4单独感染组,即在鸡胚肝细胞中,ARV可以促进FAdV-4的复制;同时感染组及时序性感染组中ARV的病毒载量和ARV单独感染组无显著差异,表明FAdV-4在鸡胚肝细胞中对ARV感染和复制无促进作用。4、ARV促进FAdV-4复制分子机制ARV感染可导致宿主天然免疫抑制,为研究ARV促进FAdV-4复制的相关机制,我们构建了ARV和FAdV-4单独感染及同时感染HEK293的细胞模型,并构建σA及σC蛋白表达载体评价ARV编码的蛋白在调控宿主天然免疫及促进FAdV-4复制的相关作用。间接免疫荧光检测结果显示,在24 hpi和48 hpi,ARV和FAdV-4均可以同时感染一个HEK293细胞。ARV的σA蛋白可以通过干扰IFN-α的产生进而抑制HEK293细胞的抗病毒活性,FAdV-4复制水平提高,而σC蛋白对宿主天然免疫及FAdV-4的复制无明显影响。综上所述,本研究从不同层面证明了ARV和FAdV-4的协同致病性并初步揭示了ARV的σA蛋白通过抑制宿主先天性免疫应答,促进FAdV-4复制的分子机制,可为禽病毒性关节炎和HHS的防控提供一定科学思路,同时也为进一步阐明ARV和FAdV-4协同致病机制提供了新思路、新论据。

关键词：禽呼肠孤病毒血清4型Ⅰ群禽腺病毒共感染协同致病性 IFN-α

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染协同致病性的研究

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染协同致病...

作者：范培虎中国农业科学院

学位级别：硕士

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）,是由PRRSV在NSP2基因（Nonstructural protein 2）上缺失90个核苷酸形成的突变株,能够引起不同生长阶段猪高热、高发病率和高死亡率,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒2型（Porcine cirovirus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原。近年来,国内外有关PRRSV与PCV2共感染报告较多,引起广泛关注。鉴于我国猪群中HP-PRRSV和PCV2共感染现象相当严重,掌握两种病毒的变异情况,深入了解这两种病毒的协同致病作用十分重要。本研究对两种病毒共感染进行了流行病学调查,对其流行毒株进行了遗传变异分析,并通过用两种病毒不同时间顺序感染猪试验建立了共感染动物模型,为我国HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。为掌握HP-PRRSV的变异情况,揭示该病的发生规律,本研究采用RT-PCR法对2005～2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5～7基因片段扩增和测序,所得序列与GenBank下载的PRRSV CH-1a、VR2332、HB-2、LV株的ORF5序列进行相似性比较,并与国内已发表的27株PRRSV ORF5序列进行了遗传进化树分析;此外,对GP5蛋白潜在糖基化位点与数目进行了预测与分析。结果表明,9个流行毒株同属于一个基因亚群,其ORF5序列相似性为95.0%～99.2%,氨基酸序列相似性为92.0%～99.0%;与4个参考毒株的ORF5序列相似性依次为93.4%～95.5%、87.6%～89.4%、91.2%～92.7%、63.0%～64.0%,氨基酸序列的相似性依次为91.0%～94.0%、85.6%～88.6%、89.6%～92.0%、54.7%～58.2%;GP5糖基化位点分析:存在5个糖基化位点有3株,4个糖基化位点有5株,3个糖基化位点有1株;这些糖基化位点分布在第30～55位氨基酸之间,以第44、55位点保守,另3个位点存在变异。我国猪群中HP-PRRSV流行毒株变异幅度较大,GP5糖基化位点不同可能与毒力存在一定联系。根据GenBank登录的PRRSV和PCV2基因序列设计引物,采用RT-PCR和PCR法对2005～2010年间送检的282份病料进行了HP-PRRSV和PCV2核酸检测,旨在了解HP-PRRSV和PCV2的在猪群中的共同感染情况。结果表明,病料PRRSV核酸阳性检出率为18.8%,PCV2核酸阳性检出率为35.3%（101/282）,PRRSV和PCV2共感染核酸阳性检出率为10.7%,我国猪群中PRRSV和PCV2共感染现象较为普遍。为阐明HP-PRRSV和PCV2的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3 CD4 CD8、CD3 CD4 CD8、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。试验结果表明,HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子（尤以TNF-α）变化也最为明显。临床猪群中HP-PRRSV和PCV2普遍存在共感染,猪群感染HP-PRRSV后再感染PCV2,可明显提高猪群发病率和死亡率。无论从宏观还是微观水平,这两种病毒协调感染均能显著促进在猪体的病毒复制,进而导致更严重的临床症状和病理损伤。本研究为深入探讨这两病毒的协同致病机制奠定了基础,也为临床遇到的PRRSV与PCV2混合感染引起的疫病防控提供了科学依据。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型遗传变异共感染协同致病性

PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型的建立及协同致病性研究

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PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型的建立及协同致病性研究

作者：舒祥力河南农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪急性腹泻的主要猪肠道冠状病毒。PEDV与PDCoV共感染现象在猪群中很普遍,严重影响养猪业的健康发展,但PEDV与PDCoV协... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪急性腹泻的主要猪肠道冠状病毒。PEDV与PDCoV共感染现象在猪群中很普遍,严重影响养猪业的健康发展,但PEDV与PDCoV协同感染的临床结果尚不清楚。在本研究中,我们将PEDV与PDCoV按不同的接种顺序感染4日龄健康仔猪,通过体重变化、腹泻情况和组织病理学评估,建立了PEDV与PDCoV共感染的动物模型;然后通过对仔猪的粪便排毒、组织病毒载量、组织病理学变化、炎症细胞因子表达和结肠微生物组成结构的分析,研究了PEDV与PDCoV共感染对仔猪致病性的影响;最后分析了PEDV与PDCoV体外共感染猪树突状细胞(Dendritic cells,DC)诱导炎性因子表达的情况。本研究为PEDV与PDCoV共感染致病机制的研究奠定了基础。具体研究内容如下:***与PDCoV共感染仔猪动物模型的建立试验选取30头4日龄健康仔猪,随机分成6组:对照组、PDCoV组、PEDV组、PEDV/PDCoV组(PEDV先感染12 h再感染PDCoV)、PDCoV-PEDV组(PEDV和PDCoV同时感染)和PDCoV/PEDV组(PDCoV先感染12 h再感染PEDV),每组5头仔猪。PDCoV组的仔猪口服病毒液5×10 TCID/头,PEDV组的仔猪口服病毒液1×10 TCID/头,共感染组仔猪口服PDCoV 5×10 TCID和PEDV 1×10 TCID/头,对照组的仔猪口服细胞培养液。在试验期间,每天观察仔猪的临床症状,并记录仔猪体重和腹泻情况。在感染后第3天,每组选取3头仔猪进行剖检,观察仔猪的病理剖检情况,采集心、肝、脾、肺、肾、小肠(十二指肠、空肠和回肠)、大肠(结肠、盲肠和直肠)组织,用q RT-PCR检测病毒的组织分布情况,用H&E染色对小肠进行组织病理学检查,计算小肠绒毛高度与隐窝深度比值(VH:CD)。结果显示,与PDCoV或PEDV单独感染组相比,3组PEDV与PDCoV共感染仔猪的腹泻程度更严重,腹泻时间明显延长,体重增加显著减缓。选择PEDV与PDCoV同时感染组仔猪进行进一步检测,结果显示共感染组的仔猪小肠明显变薄、肠绒毛萎缩、坏死和脱落,仔猪小肠绒毛萎缩程度显著高于单独感染仔猪。q RT-PCR结果显示PEDV与PDCoV在小肠组织的病毒载量较高。以上结果表明我们成功建立了PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型。***与PDCoV共感染对仔猪协同致病性的研究在成功建立PEDV与PDCoV共感染仔猪动物模型的基础上,开展PEDV与PDCoV共感染致病性研究。PEDV与PDCoV共感染仔猪后,通过q RT-PCR检测仔猪粪便和小肠组织中病毒含量,免疫组织化学检测仔猪小肠组织中病毒分布,利用ELISA测定仔猪血清中炎性因子的含量,应用16S r RNA测序分析仔猪结肠微生物组成结构变化。结果显示与PEDV与PDCoV单独感染组相比,共感染组仔猪粪便和小肠组织中PDCoV载量显著升高(p性因子(IL-6、IL-8和TNF-α)分泌量显著增加(p性分析显示光冈菌属与TNF-α和IL-6分泌呈正相关。以上结果表明PEDV与PDCoV共感染仔猪存在协同致病性。***与PDCoV共感染DC对炎性因子表达的影响在PEDV与PDCoV共感染能够加重仔猪肠道损伤和炎性因子表达的基础上,进一步开展PEDV与PDCoV共感染DC对炎性因子表达的影响。从猪外周血中分离诱导出未成熟DC,用PEDV与PDCoV共感染DC,通过q RT-PCR和间接免疫荧光检测(IFA)等技术研究PEDV与PDCoV在DC上的感染以及对炎性因子表达的影响。结果显示PEDV与PDCoV在感染DC后3-12 h病毒拷贝数均显著升高,并在24 hpi开始下降;上清中病毒滴度在3-24 hpi持续上升,并且在24 hpi最高。IFA结果显示在单独感染组和共同感染组中均检测到PEDV与PDCoV抗原。与单独感染组相比,PEDV与PDCoV共感染DC后细胞中炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8)表达量显著升高。以上结果表明P

关键词：猪流行性腹泻病毒猪δ冠状病毒共感染协同致病性仔猪模型

高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性试验

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高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性试验

高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺... 详细信息

为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。试验结果表明,HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。临床猪群中HP-PRRSV和PCV2普遍存在共感染,猪群感染HP-PRRSV后再感染PCV2,可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型共感染协同致病性

来源： cnki会议评论

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高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒感染仔猪致病性影响的研究

生态环境与畜牧业可持续发展学术研讨会暨中国畜牧兽医学会2012年学术年会和第七届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会会议

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。试验结果表明,HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用,且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型共感染协同致病性

来源： cnki会议评论

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猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒感染仔猪致病性影响的研究

作者：张浩中国农业科学院

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种猪肠道冠状病毒,导致全日龄猪只呕吐腹泻,对10日龄内仔猪的致死率高达100%,该病毒感染广泛,给世界各国养猪业带来巨大经济损失。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种猪肠道冠状病毒,导致全日龄猪只呕吐腹泻,对10日龄内仔猪的致死率高达100%,该病毒感染广泛,给世界各国养猪业带来巨大经济损失。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)同样在全世界猪群中广泛存在,引发包括断乳仔猪多系统衰竭综合征在内的多种猪圆环病毒相关疾病,经济损失也不容小觑。研究表明,PCV2与PEDV的共感染比较常见,在日本、韩国和中国等国家均有发现。目前只有韩国学者研究发现,若胎猪在出生前21天被PCV2感染,出生后再感染PEDV,比未提前感染PCV2的仔猪的肠道病理损伤更加严重。为了更加深入的了解PCV2对PEDV的影响,本研究共开展了三部分的工作:1)探究PCV2在断乳仔猪各肠道的分布情况,及PCV2猪肠道上皮细胞系中的感染与复制能力;2)建立PCV2与PEDV体外共感染模型,并探究PCV2对PEDV复制的影响;3)建立PCV2与PEDV顺序感染的初生仔猪模型,探究PCV2感染早期对PEDV致病性的影响。选择目前流行的PCV2d-LNHC毒株感染断乳仔猪,采用毒价测定和q PCR方法对仔猪各肠段内PCV2d-LNHC的分布进行定量研究,结果显示,在攻毒4周后全部仔猪的空肠和回肠均分离到PCV2感染性病毒粒子并检出PCV2核酸,毒价可达到10和10 TCID/g,而对照组仔猪空肠和回肠均未检出感染性病毒粒子或病毒核酸。同时,我们还基于毒价测定的方法检测了PCV2d-LNHC毒株在体外对pH=2.0的酸性环境的耐受能力,初步证明了PCV2d-LNHC毒株可以耐受胃酸的酸性环境并保持一定的感染力。最后采用IPMA、IFA和毒价测定方法确认了PCV2d-LNHC毒株对猪空肠上皮细胞传代细胞系(IPEC-J2)和猪回肠上皮传代细胞系(IPI-FX)的感染及复制能力,为后续PCV2与PEDV体外共感染模型的建立打下了基础。既然IPI-FX细胞可以支持PCV2的复制,且又是PEDV的靶细胞,我们就以该细胞为基础建立了PCV2和PEDV共感染模型。采用IFA方法研究PCV2和PEDV在IPI-FX细胞共感染情况,通过激光共聚焦显微镜观察到PEDV和PCV2既可以单独感染细胞又可以共同感染同一细胞。在该模型中,我们用q PCR、western blot和毒价测定等方法探索PCV2感染对PEDV复制的影响。结果显示:当PCV2先感染IPI-FX细胞,对PEDV的复制有明显的抑制作用,以2 MOI、1 MOI、0.25 MOI和0.1 MOI的PCV2d-LNHC与5 MOI的PEDV顺序感染后,PEDV N基因m RNA水平分别下降59.3%、72.4%、7.8%和31.8%,这种抑制作用呈剂量和时间依赖关系,同时检测到宿主IFN-β、TNF-α、IL-1β和OASL的m RNAs水平降低;当PCV2和PEDV同步感染IPI-FX细胞时,PCV2可以促进PEDV的复制,2 MOI PEDV和1 MOI、0.5 MOI或0.25 MOI PCV2同时感染时,PEDV N m RNA分别增加517%、743%和307%,此时细胞中IFN-β、TNF-α、IL-1β和OASL的m RNAs的水平上调。这些结果表明,IPI-FX细胞是研究PCV2和PEDV混合感染的良好模型。为了进一步在猪体内探究PCV2感染早期对PEDV致病性的影响,我们选取了PCV2抗原和抗体双阴的初生仔猪,先后感染PCV2和PEDV。采用PCR方法于PCV2感染后7天检测到被PCV2感染的仔猪出现了病毒血症,而其它对照仔猪PCV2阴性,于是进行了后续的PEDV攻毒实验。临床症状观察结果显示:PEDV单感染组与PCV2-PEDV顺序感染组仔猪均在感染后16 h出现腹泻同时伴有食欲下降等症状;从感染后32 h开始,PEDV单感染组仔猪出现明显的精神沉郁,并在40 h进入濒死状态,而顺序感染组仔猪精神状态稍差,仍有食欲,并在试验结束时全部存活。采用定量PCR方法检测各组织的PEDV N基因m RNA含量,发现PEDV单感染组和PCV2-PEDV顺序感染组所有仔猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肠系膜淋巴结中均检测到PEDV核酸,其中空肠和回肠组织中的平均病毒载量最高。对比PEDV单感染组和PCV2-PEDV顺序感染组仔猪的病毒载量,可发现PCV2-PEDV顺序感染组仔猪肠道中病毒载量更高,但并没有显著性差异。随后采用H.E.染色和IHC方法检测实验猪空肠和回肠的病理变化和PEDV抗原分布,结果显示,PEDV单感染组仔猪空肠和回肠上皮细胞大量坏死脱落,而PCV2-PEDV顺序感染组仔猪的空肠和回肠上皮细胞多量变性,因此造成PEDV单感染

关键词：猪流行性腹泻病毒猪圆环病毒2型猪小肠上皮细胞共感染协同致病性

鸡呼肠孤病毒和金黄色葡萄球菌对SPF鸡的协同致病作用研究

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鸡呼肠孤病毒和金黄色葡萄球菌对SPF鸡的协同致病作用研究

作者：高玲山东农业大学

学位级别：硕士

禽关节炎是一种养禽业中比较常见的疾病,该病病因较为复杂,其中细菌性关节炎常由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus,SA)感染引起,病毒性关节炎的病原为禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)。除单独感染外,在临床上经常发生二者的混合... 详细信息

禽关节炎是一种养禽业中比较常见的疾病,该病病因较为复杂,其中细菌性关节炎常由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus,SA)感染引起,病毒性关节炎的病原为禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)。除单独感染外,在临床上经常发生二者的混合感染,主要表现为精神沉郁、采食困难,禽跗关节/趾关节肿胀、瘫痪、站立困难等病症,患病禽只生长迟缓、生产性能下降,严重影响着养殖业的生产效益。针对该现象我们开展了如下研究:为确定禽关节炎发生的原因,2020.10～2021.10期间我们采集了共计77份山东省不同地区养殖场的鸡跗关节肿胀病料,对上述病料进行RT-PCR检测以确定有无ARV的感染;使用甘露醇氯化钠琼脂培养基分离细菌,以确定有无SA的感染。结果显示,在77份鸡跗关节肿胀病料中,单独感染ARV的占比为22%,单独感染SA的占比为19%,ARV与SA共感染的占比为46%,显然二者共感染是造成鸡关节炎的主要病因。在此基础上我们进行了鸡呼肠孤病毒、金黄色葡萄球菌单独感染与共感染对SPF鸡的致病性研究。本研究将240只1日龄SPF鸡随机分为8组:A组,单独感染ARV;B组,单独感染SA;C组,同时感染ARV与SA;D组,先感染ARV,12 h后感染SA;E组,先感染SA,12 h后感染ARV;F组,先感染ARV,24 h后感染SA;G组,先感染SA,24 h后感染ARV;H组,对照组。ARV通过脚垫进行接种,SA涂抹关节进行接种,连续观察30 d,同时记录试验鸡的体重、跗关节直径、临床症状、病理变化以及死亡率,并在1 dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、10 dpi、14 dpi、18 dpi、22 dpi、26 dpi及30dpi时,每组随机取3只,分别收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、胸腺、腺胃、大脑、法氏囊、胰腺和肌腱进行SA的检测;收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、十二指肠、肌腱以及跗关节皮肤进行病理组织学检查;收集主要免疫器官和肌腱进行ARV病毒载量的检测,同时利用泄殖腔棉拭子检测了试验鸡的排毒情况,并且采血进行主要细胞因子水平、ARV抗体水平和病毒载量的测定。结果显示,单独感染组与共感染组的体重均显著低于对照组(p协同致病作用,并初步揭示了ARV与SA在SPF鸡体内的感染及分布规律。上述研究为临床禽关节炎的防控提供了一定的试验依据。

关键词：鸡呼肠孤病毒金黄色葡萄球菌共感染跗关节协同致病性