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华蟾毒它灵降低ARF6蛋白的表达抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖

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检验医学与临床 2021年第17期18卷 2484-2486页

作者：刘智慧张蓓南京中医药大学江苏南京210023 徐州市中心医院妇产科江苏徐州221000

目的探究二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)蛋白在人卵巢癌中的表达情况及对患者预后的影响,并初步探讨华蟾毒它灵(CINO)抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖的可能机制。方法免疫组化染色检测人正常卵巢组织及浆液性卵巢癌组织内ARF6蛋白的表达情况... 详细信息

目的探究二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)蛋白在人卵巢癌中的表达情况及对患者预后的影响,并初步探讨华蟾毒它灵(CINO)抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖的可能机制。方法免疫组化染色检测人正常卵巢组织及浆液性卵巢癌组织内ARF6蛋白的表达情况,采用Kaplan-Meier生存曲线分析ARF6蛋白表达水平对患者预后的影响。选取人卵巢癌细胞SKOV3,以0、0.5、1.0、2.0μmol/L的CINO分别作用于细胞,采用蛋白质免疫印迹法检测药物处理后的SKOV3中ARF6蛋白的表达。结果浆液性卵巢癌组织内ARF6蛋白的阳性表达率高于正常卵巢组织,ARF6蛋白阳性表达的患者3年总生存率比阴性表达患者低,差异有统计学意义(P<0.05);0.5、1.0、2.0μmol/L的CINO均能抑制卵巢癌SKOV3细胞中ARF6蛋白表达。结论ARF6蛋白在浆液性卵巢癌组织中高表达,且与患者不良预后有关,ARF6蛋白可能是浆液性卵巢癌患者的早期诊断及预后评价的有效分子标志物。CINO抑制人卵巢癌细胞SKOV3的体外增殖能力可能与其下调ARF6蛋白的表达有关。

关键词：华蟾毒它灵二磷酸腺苷核糖基化因子6 卵巢癌预后

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华蟾毒它灵通过线粒体途径引起肝癌细胞凋亡

中国病理生理杂志 2021年第4期37卷 646-653页

作者：潘越胡思宏王佳鑫李柯金张亚霖余诗佳刘红亮鲍登克杨虎山河南大学药学院肿瘤标志物与液体活检实验室河南开封475004 信阳职业技术学院河南信阳464000

目的:探讨华蟾毒它灵对肝癌细胞增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测法检测华蟾毒它灵对肝癌细胞株SNU-739存活和毒性的影响。通过细胞集落形成实验和EdU细胞增殖实验研究华蟾毒它灵对... 详细信息

目的:探讨华蟾毒它灵对肝癌细胞增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测法检测华蟾毒它灵对肝癌细胞株SNU-739存活和毒性的影响。通过细胞集落形成实验和EdU细胞增殖实验研究华蟾毒它灵对SNU-739细胞增殖的作用。利用DAPI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测华蟾毒它灵对SNU-739细胞凋亡的影响。采用RT-qPCR和Western blot法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax的水平及NF-κB p65活化的情况。通过JC-1荧光探针试剂盒和ATP检测试剂盒研究华蟾毒它灵对SNU-739细胞线粒体功能的影响。利用裸鼠体外成瘤实验研究华蟾毒它灵在体内对肝癌组织生长的影响。结果:MTT和LDH检测结果表明华蟾毒它灵可抑制肝癌细胞的活性(P华蟾毒它灵可显著抑制肝癌细胞增殖(P华蟾毒它灵处理后SNU-739细胞的核出现染色质凋亡形态。TUNEL染色和流式细胞检测结果显示,华蟾毒它灵可促进肝癌细胞凋亡(P华蟾毒它灵处理后,SNU-739细胞内Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Bax/Bcl-2比例升高(P华蟾毒它灵作用后,肝癌细胞的线粒体膜电位呈现明显的下降趋势,ATP的生成量也显著减少(P华蟾毒它灵能够明显抑制体内肝肿瘤组织的生长(P华蟾毒它灵能抑制肝癌细胞的增殖,并通过线粒体途径促进肝癌细胞凋亡。

关键词：华蟾毒它灵肝细胞癌细胞增殖细胞凋亡线粒体

华蟾毒它灵通过下调β-catenin抑制肝癌细胞的上皮间质转化

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华蟾毒它灵通过下调β-catenin抑制肝癌细胞的上皮间质转化

作者：张晓静河南大学

学位级别：硕士

实验目的:肝癌是全世界范围内与癌症相关的最常见的死亡原因之一。肝癌术后复发率及转移率较高,患者的预后较差,而中国是肝癌高发区。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肝癌转移中扮演关键角色,与肝癌侵袭、肝内... 详细信息

实验目的:肝癌是全世界范围内与癌症相关的最常见的死亡原因之一。肝癌术后复发率及转移率较高,患者的预后较差,而中国是肝癌高发区。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肝癌转移中扮演关键角色,与肝癌侵袭、肝内转移及低存活率密切相关。因此,抑制肝癌细胞发生EMT具有重要意义。华蟾毒它灵(Cinobufotalin)是中药蟾酥的主要成分之一,具有广谱的抗肿瘤活性。本实验的目的是探讨cinobufotalin能否抑制肝癌细胞的EMT和转移,并初步探讨其分子机制。实验方法:本实验采用CCK-8法检测cinobufotalin对肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞增殖的影响;用倒置显微镜观察cinobufotalin对细胞形态学的影响;Western blotting实验检测cinobufotalin对两种肝癌细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、Slug、ZEB1)和迁移相关蛋白(β-catenin、DKK1、MMP7)表达的影响;wound healing实验、transwell迁移实验和transwell侵袭实验评价cinobufotalin对肝癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响;用荧光定量PCR法和western blotting法检测cinobufotalin对肝癌细胞中β-catenin基因表达和其细胞浆与细胞核中β-catenin蛋白表达量的影响;采用瞬时转染法,构建β-catenin过表达和β-catenin敲减的Hep G2和SMMC-7721细胞模型。基于上述细胞模型,检测β-catenin在cinobufotalin调控Hep G2和SMMC-7721细胞EMT中的作用;建立BALB/c小鼠肺转移瘤模型,在动物水平评价cinobufotalin对肿瘤细胞EMT和转移的影响;通过免疫组化实验,检测小鼠肺肿瘤灶中EMT相关蛋白的表达。实验结果:1、CCK-8实验结果表明,cinobufotalin抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的增殖并呈时间依赖性和剂量依赖性。2、用cinobufotalin处理肝癌细胞24 h后,可以发现在给药前后,细胞形态从纺锤形的间充质样形状转变为椭圆形的上皮样形状。3、Western blotting实验结果表明,在肝癌细胞中cinobufotalin能显著影响EMT相关蛋白的表达,即上调上皮标志蛋白E-cadherin的表达,抑制间充质标志蛋白Vimentin、ZEB1、Slug、Snail和N-cadherin的表达。4、Wound healing、transwell迁移和侵袭实验的实验结果显示,cinobufotalin能显著抑制肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。5、实时荧光定量PCR实验和western blotting实验结果表明,cinobufotalin显著降低β-catenin mRNA和蛋白的表达,并抑制β-catenin核蛋白的表达。6、本实验成功构建了β-catenin过表达的肝癌细胞株模型。Western blotting实验结果表明,β-catenin过表达可促进肝癌细胞株的EMT活性,而cinobufotalin能逆转过表达β-catenin对EMT相关蛋白的调控作用。Wound healing、transwell迁移和侵袭实验结果显示,cinobufotalin明显逆转了过表达β-catenin对肝癌细胞迁移和侵袭能力的诱导作用。7、本实验成功构建了β-catenin低表达的肝癌细胞株模型。本部分实验的实验结果显示,在Hep G2和SMMC-7721细胞中,β-catenin低表达显著抑制细胞株的EMT活性及迁移与侵袭能力,且cinobufotalin使该抑制作用增强。8、动物实验结果表明,cinobufotalin显著抑制BALB/c小鼠肿瘤肺转移灶的形成和转移。9、免疫组化实验结果显示,在动物水平,cinobufotalin抑制肿瘤发生EMT。实验结论:Cinobufotalin通过下调β-catenin的表达抑制肝癌细胞发生EMT,进而抑制肝癌细胞的转移和侵袭。

关键词：肝癌上皮间质转化华蟾毒它灵 β-catenin

静脉注射蟾毒它灵和华蟾毒它灵后大鼠胆汁中代谢产物的UPLC-UV-MS法分析

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中国医药工业杂志 2011年第9期42卷 676-680页

作者：王也牧丁存刚于垂亮李周葛庆华中国医药工业研究院总院药物制剂国家工程研究中心上海201203

建立了超高效液相色谱-紫外分光光度-质谱(UPLC-UV-MS)法研究蟾毒它灵和华蟾毒它灵静脉给药后大鼠胆汁中的代谢产物。UPLC的高分辨率能够基线分离胆汁中的原药和代谢物,UV光谱图揭示了各种化合物量的关系,MS进一步对代谢物进行结构表征... 详细信息

建立了超高效液相色谱-紫外分光光度-质谱(UPLC-UV-MS)法研究蟾毒它灵和华蟾毒它灵静脉给药后大鼠胆汁中的代谢产物。UPLC的高分辨率能够基线分离胆汁中的原药和代谢物,UV光谱图揭示了各种化合物量的关系,MS进一步对代谢物进行结构表征。结果显示,大鼠胆汁中原药的含量小于5%,主要代谢物是去乙酰基并羟基化蟾毒它灵和去乙酰基华蟾毒它灵。表明蟾毒它灵在大鼠体内代谢途径主要是水解并羟基化,华蟾毒它灵主要是水解反应。

关键词：蟾毒它灵华蟾毒它灵蟾蜍甾烯超高效液相色谱药物代谢

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蟾酥干燥炮制前后化学成分和药效学变化考察

中草药 2018年第8期49卷 1816-1822页

作者：陈瀛澜郭夫江卞雪莲董志颖吴迎春李医明上海中医药大学中药学院上海201203 上海金蟾健康科技有限公司上海201900

目的考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化。方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制... 详细信息

目的考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化。方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果。结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6%;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果。结论日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状。真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化。

关键词：蟾酥炮制干燥沙蟾毒精远华蟾毒精蟾毒它灵华蟾毒它灵蟾毒灵华蟾酥毒基脂蟾毒配基

蟾酥原浆HPLC指纹图谱建立及8种成分含量测定

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中草药 2020年第2期51卷 490-495页

作者：张东红金辉辉刘星雨方倩倩姚建标王伟王如伟浙江中医药大学药学院浙江杭州310052 浙江康恩贝制药股份有限公司浙江杭州310052 浙江省中药制药技术重点实验室浙江杭州310052 内蒙古康恩贝药业有限公司圣龙分公司内蒙古鄂尔多斯017415

目的建立蟾酥原浆HPLC指纹图谱及原浆中8种成分含量测定方法,对不同产地蟾酥原浆进行成分含量差异比较,同时进行质量评价。方法以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,检测波长296 nm,体积流量1.2 m L/min,柱温30℃,进样量10μL;建立蟾酥原浆指纹... 详细信息

目的建立蟾酥原浆HPLC指纹图谱及原浆中8种成分含量测定方法,对不同产地蟾酥原浆进行成分含量差异比较,同时进行质量评价。方法以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,检测波长296 nm,体积流量1.2 m L/min,柱温30℃,进样量10μL;建立蟾酥原浆指纹图谱,测定8个成分含量,对结果进行聚类分析和主成分分析。结果 18批样品指纹图谱中有12个共有峰,各样品相似度有所差异,8个成分在各自范围内线性关系良好(r2≥0.999 5),精密度、重复性RSD蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾蜍精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基回收率平均值分别为103.7%、103.0%、102.9%、103.0%、103.9%、100.3%、103.4%、103.2%,且RSD均小于1.2%,8个成分含量测定结果及聚类分析和主成分分析结果可知不同产地原浆质量有所差异。结论该方法简便可靠,为蟾酥原浆质量把控提供一定依据及参考。

关键词：蟾酥原浆 HPLC 日蟾毒它灵沙蟾毒精远华蟾蜍精蟾毒它灵华蟾毒它灵蟾毒灵华蟾酥毒基脂蟾毒配基指纹图谱聚类分析主成分分析

HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物

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中草药 2017年第4期48卷 700-705页

作者：李娟狄留庆李俊松钱静王恒斌李全南京中医药大学药学院江苏南京210023 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心江苏南京210023 南京市中药微丸产业化工程技术研究中心江苏南京210023 雷允上药业有限公司江苏苏州215009

目的建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法。方法采用ODS-2(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-... 详细信息

目的建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法。方法采用ODS-2(250 mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.15%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1 mL/min,柱温40℃,检测波长296 nm。HPLC-MS联用的色谱条件与HPLC分离基本条件一致,流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液。通过电喷雾离子源,正离子模式扫描,对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物进行分析鉴别。结果 9种蟾蜍二烯内酯类化合物均得到良好分离,线性关系良好(r≥0.999 6)。加样回收率均在92%~105%,RSD蟾蜍二烯内酯类化合物的量,分别为和蟾蜍他灵0.40~0.88 mg/g,沙蟾毒精0.32~0.83 mg/g,远华蟾毒精0.61~2.11 mg/g,去乙酰华蟾毒它灵0.15~0.32 mg/g,蟾毒它灵0.84~1.85 mg/g,华蟾毒它灵25.76~62.14 mg/g,蟾毒灵0.96~2.06 mg/g,华蟾酥毒基2.30~4.75 mg/g,脂蟾毒配基1.20~2.61 mg/g。结论所建立的定量测定方法简便、快速、准确可靠,专属性强,可用于六神丸的质量控制。

关键词：六神丸蟾酥蟾蜍二烯内酯 HPLC 和蟾蜍他灵沙蟾毒精远华蟾毒精去乙酰华蟾毒它灵蟾毒它灵华蟾毒它灵蟾毒灵华蟾酥毒基脂蟾毒配基

基于大鼠胸主动脉血管环的蟾酥舒缩调控作用研究及效应成分发现

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中草药 2022年第2期53卷 484-493页

作者：黄蓓蓓陈奕君吴浩刘洁冯梦晗刘力榕王伟肖红斌北京中医药大学中药学院北京100029 北京中医药大学中药分析与转化研究中心北京100029 北京中医药大学中医药研究院北京100029 广州中医药大学方证研究所广东广州510006

目的揭示蟾酥提取物对大鼠胸主动脉血管环舒缩的双向调控作用及潜在效应成分组成。方法利用离体生物能量信号采集系统,评价蟾酥提取物及其水洗脱部位和70%乙醇洗脱部位对大鼠胸主动脉血管环的舒缩调控作用;并在此基础上,建立UHPLC-Q TOF... 详细信息

目的揭示蟾酥提取物对大鼠胸主动脉血管环舒缩的双向调控作用及潜在效应成分组成。方法利用离体生物能量信号采集系统,评价蟾酥提取物及其水洗脱部位和70%乙醇洗脱部位对大鼠胸主动脉血管环的舒缩调控作用;并在此基础上,建立UHPLC-Q TOF-MS/MS联用方法,对各样品进行成分解析;根据成分鉴定结果,逐一考察其中主要成分的血管调控效应。结果蟾酥提取物对静息状态下的大鼠胸主动脉血管环表现出先收缩后舒张的双向调控作用;而其水洗脱部位仅表现出血管收缩效应,70%乙醇洗脱部位仅表现出血管舒张效应。进一步研究发现,肾上腺素、5-羟色胺是蟾酥提取物水洗脱部位中发挥血管收缩效应的主要成分;而华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精和脂蟾毒精是蟾酥提取物70%乙醇洗脱部位中发挥血管舒张效应的主要成分。结论蟾酥提取物对于血管舒缩的双向调控作用,与其中水溶性成分肾上腺素、5-羟色胺诱导血管收缩,脂溶性成分华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精和脂蟾毒精诱导血管舒张密切相关,为中药单味药多成分作用于同一器官的多靶点协同拮抗调控效应研究提供了数据支撑。

关键词：蟾酥胸主动脉血管环双向调控作用效应成分肾上腺素 5-羟色胺华蟾酥毒基酯蟾毒配基华蟾毒它灵去乙酰华蟾毒精脂蟾毒精

干蟾皮及其炮制品的指纹图谱建立与化学模式识别

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药物分析杂志 2022年第5期42卷 875-883页

作者：周谧徐丹洋孙成静钱洁南通市食品药品监督检验中心南通226006

目的:建立干蟾皮生品及炮制品UPLC指纹图谱,并同时测定干蟾皮中指标性成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、沙蟾毒精-3-辛二醇辛酯的含量,通过化学模式识别控制干蟾皮质量。... 详细信息

目的:建立干蟾皮生品及炮制品UPLC指纹图谱,并同时测定干蟾皮中指标性成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、沙蟾毒精-3-辛二醇辛酯的含量,通过化学模式识别控制干蟾皮质量。方法:干蟾皮的甲醇提取液的分析采用Waters Acquity UPLC BEH色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),以乙腈-0.5%乙酸为流动相,梯度洗脱,流速为0.2 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为296 nm。结果:12批生品和12批炮制品的总含量分别为3.18~4.69 mg·g^(-1)和0.91~2.77 mg·g^(-1),指纹图谱中均有9个共有峰,相似度分别为0.963~0.991和0.692~0.988,主成分分析和聚类分析能很好地识别干蟾皮的生品和炮制品。结论:该方法稳定、可靠,可为干蟾皮的质量控制、炮制工艺,进一步开发研究提供科学依据。

关键词：日蟾毒它灵沙蟾毒精蟾蜍它里定蟾毒它灵华蟾毒它灵蟾毒灵华蟾酥毒基脂蟾毒配基沙蟾毒精-3-辛二醇辛酯干蟾皮 UPLC 指纹图谱化学模式识别