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中华老年医学杂志 2003年第7期22卷 417-420页

作者：林正马中富黄帆徐康 LIU Alice YC 中山大学附属第一医院中心实验室广州市510080 Department of CellBiology and Neuroscience

目的　评价半胱氨酸巯基氧化还原介导剂对人热休克转录因子 1(hHSF1)的氧化还原状态、结构和功能的作用 ,并试图去解释氧化作用在细胞衰老中对hHSF1转录反应的影响。　方法　通过改良的Westernblot方法检测不同氧化还原介导剂对hHSF1构... 详细信息

目的　评价半胱氨酸巯基氧化还原介导剂对人热休克转录因子 1(hHSF1)的氧化还原状态、结构和功能的作用 ,并试图去解释氧化作用在细胞衰老中对hHSF1转录反应的影响。　方法　通过改良的Westernblot方法检测不同氧化还原介导剂对hHSF1构象的影响 ;通过凝胶电泳迁移率变动试验检测hHSF1的DNA的结合活性。　结果　促进二硫键交联的氧化型介导剂二酰胺(DM )、一氧化氮 (NO+ )载体亚硝基谷胱甘肽 (GSNO)与含hHSF1的HeLa细胞S10 0提取液预培育 ,能在体外形成一个致密的、电泳中移动快速、分子内二硫键交联的氧化型hHSF1(ox hHSF1)单体构象 ;在电泳前加入还原型介导剂二硫苏糖醇 (DTT)能完全逆转。由于ox hHSF1形成 ,使hHSF1在体外不能被热诱导激活形成三体 ,失去和DNA结合的活性 ,而且这个作用仅对含半胱氨酸巯基的转录因子有特异性。　结论　hHSF1功能反应与其半胱氨酸巯基的氧化还原化学性能相关 ,氧化作用和hHSF1分子内二硫键交联有可能是衰老细胞热休克转录反应呈渐减性的原因。

关键词：人热休克转录因子1 半胱氨酸巯基氧化还原衰老细胞

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硫化氢信号分子与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用机制的研究

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分析化学 2018年第7期46卷 1145-1151页

作者：朱艳雯刘玲孙玮洁颜廷才檀德宏张瑶白冰沈阳农业大学食品学院沈阳师范大学美术与设计学院

硫化氢（H;S）作为信号分子与目标蛋白相互作用而实现信号传导机制的研究一直是研究热点。本研究以L-乳酸脱氢酶为目标蛋白,选用3种H;S供体试剂（NaHS、Na;S、PS）,采用分子荧光实时监测L-乳酸脱氢酶活性变化,研究H;S与目标蛋白的相互... 详细信息

硫化氢（H;S）作为信号分子与目标蛋白相互作用而实现信号传导机制的研究一直是研究热点。本研究以L-乳酸脱氢酶为目标蛋白,选用3种H;S供体试剂（NaHS、Na;S、PS）,采用分子荧光实时监测L-乳酸脱氢酶活性变化,研究H;S与目标蛋白的相互作用。SDS-PAGE电泳结果显示,H;S不是通过形成二硫键/三硫键的方式与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用;圆二色谱结果表明,L-乳酸脱氢酶的二级结构发生变化,提示H;S可能存在半胱氨酸巯基衍生能力,以硫烷硫存在的PS具有最强的巯基作用力;MALDI-TOF-MS/MS分析结果表明,L-乳酸脱氢酶蛋白中部分半胱氨酸巯基位点发生了硫烷化,进一步揭示了H;S是通过与活性半胱氨酸巯基位点硫烷化的方式与L-乳酸脱氢酶发生作用。

关键词：硫化氢 L-乳酸脱氢酶半胱氨酸巯基硫烷化

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氨基酰化酶分子中并不存在二硫键

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中国科学（B辑） 1995年第1期25卷 54-59页

作者：王洪睿张彤王泽峰王希成周海梦清华大学生物科学与技术系北京100084 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室北京100101

用NR/R双向对角线SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明氨基酰化酶分子中并不存在二硫键.MNP滴定氨基酰化酶的结果表明,酶分子中的10个半胱氨酸巯基有8个是可反应基团,另外2个内埋巯基在7mol/L盐酸胍溶液中被暴露出来,并可与MNP反应.DTNB测... 详细信息

用NR/R双向对角线SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明氨基酰化酶分子中并不存在二硫键.MNP滴定氨基酰化酶的结果表明,酶分子中的10个半胱氨酸巯基有8个是可反应基团,另外2个内埋巯基在7mol/L盐酸胍溶液中被暴露出来,并可与MNP反应.DTNB测定的结果表明,酶分子中的10个半胱氨酸巯基有4个可反应巯基,6个DTNB所不能接触的巯基经7mol/L盐酸胍变性后,可以与DTNB作用.两种巯基试剂测定的结果均表明氨基酰化酶分子中含总巯基数为10个.这一数据与氨基酰化酶序列分析所得到的半胱氨酸残基数是一致的.因此进一步证实了氨基酰化酶分子中确无二硫键的存在.

关键词：氨基酰化酶二硫键双向电泳半胱氨酸巯基

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大蒜脂溶性硫化物通过H2S介导调控脱氢酶活性机制的研究

大蒜脂溶性硫化物通过H2S介导调控脱氢酶活性机制的研究

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作者：孙玮洁沈阳农业大学

学位级别：硕士

近年来,HS作为第三种气体信号分子出现,被认为是与NO和CO类似的重要的细胞信号传导分子。研究表明,HS介导了与炎症相关的某些生理生化过程。最新的文献报道了一些大蒜硫化物在活性巯基物质的诱导下具备释放HS的潜能,如二烯丙基三硫化物(... 详细信息

近年来,HS作为第三种气体信号分子出现,被认为是与NO和CO类似的重要的细胞信号传导分子。研究表明,HS介导了与炎症相关的某些生理生化过程。最新的文献报道了一些大蒜硫化物在活性巯基物质的诱导下具备释放HS的潜能,如二烯丙基三硫化物(DATS)和二烯丙基二硫化物(DADS)。因此,HS的作用机制还值得在有机硫化物体系进一步探索;同时,蛋白酶类具备催化活性,可以实时反映HS与蛋白的作用过程;文中对多种硫化物(包括大蒜有机硫)溶液中总HS的储备能力进行了评价。结合活性酶体系,在HS机制下重新审视大蒜有机硫,以期揭示大蒜硫化物在生理活性方面新的生物学意义。实验结果如下:(1)比较并评价不同硫化物溶液中总HS的储备能力。首先,建立比色法检测溶液中的HS;其次,无机硫化物(NaS/NaHS/KS)在水溶液中就可以直接检测出HS;大蒜有机硫化物DATS/DADS/大蒜素,不能直接检测出HS,只有在活性巯基类物质GSH/DTT/ASH存在的条件下,才可以检测出HS,而二烯丙基一硫化物(DAS)则不是HS的储备物;最后,文中对所有硫化物中总HS的储备能力做出评价。其中对大蒜素中HS储备能力的揭示尚未见报道。(2)探索硫化物对酶蛋白的作用机制。首先,利用荧光光谱法实时监测乙醇脱氢酶(ADH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的活性,NaS、NaHS、KS,DATS、DADS、大蒜素(与活性巯基类物质作用后)对酶蛋白的活性均有抑制作用;其次,利用巯基氧化剂(HO)、巯基衍生剂(NEM)和巯基保护剂(DTT),推测NaS、NaHS、KS、DATS、DADS、大蒜素对酶蛋白的作用可能发生在巯基上;进而推测DATS、DADS、大蒜素的作用机制与NaS、NaHS、KS类似。(3)探索硫化物对酶蛋白作用机制的具体位点。利用圆二色谱(CD)探索酶蛋白二级结构的变化,经NaS/DADS/DATS/大蒜素处理,酶蛋白的二级结构会发生显著改变,表明HS处理可能会使酶蛋白的二级结构发生修饰作用;利用MALDI-TOF-MS/MS探索蛋白一级结构并揭示机理,DATS/DADS/大蒜素与NaS/NaHS/KS具有类似的调控蛋白的机制,通过与酶蛋白中部分半胱氨酸位点以硫烷化作用的方式,产生衍生化protein-SSH调控了蛋白活性。结果表明,大蒜脂溶性硫化物DATS/DADS/大蒜素是天然的HS储备物,具备可调控的释放HS的特性,更加安全可靠,可以作为NaS/NaHS/KS的天然替代品;本文揭示的DATS/DADS/大蒜素具备硫烷化衍生蛋白质巯基的调控机制,应该是大蒜有机硫生理活性的生物学基础,更正了大蒜硫化物的生物活性是来源于抗氧化性的错误认知。

关键词：硫化氢大蒜硫化物脱氢酶蛋白半胱氨酸巯基硫烷化

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硫化氢对葱属风味关键酶蒜酶硫烷化作用机制研究

硫化氢对葱属风味关键酶蒜酶硫烷化作用机制研究

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作者：朱艳雯沈阳农业大学

学位级别：硕士

HS是继NO、CO之后发现的第三种具有氧化还原信号传导功能的气态小分子物质。虽然HS参与多种生理过程,但它的分子作用途径仍不明晰。HS的一种作用机制可能是通过对目标蛋白巯基/二硫键的硫烷化修饰生成氢过硫化物来实现作用的。本文以有... 详细信息

HS是继NO、CO之后发现的第三种具有氧化还原信号传导功能的气态小分子物质。虽然HS参与多种生理过程,但它的分子作用途径仍不明晰。HS的一种作用机制可能是通过对目标蛋白巯基/二硫键的硫烷化修饰生成氢过硫化物来实现作用的。本文以有多个半胱氨酸巯基位点的蒜酶为目标蛋白,L-乳酸脱氢酶(L-LDH)、D-乳酸脱氢酶(D-LDH)作为验证结果正确性的辅助蛋白,三种酶在催化底物同时会消耗荧光物NADH(荧光强度越低,反映酶活性越强),从而监测HS与蛋白的相互作用,揭示出HS与三种酶蛋白的互作方式。实验结果如下:(1)研究以3种试剂(NaHS、NaS、KS)为HS供体,以分子荧光光谱法体外实时监测HS对三种酶的作用过程。在一定浓度范围内(0.125-0.5mmol/L),NaS、NaHS、PS对三种酶活性均有抑制效果,并存在浓度依存关系。实验中巯基氧化剂(HO、GSSG)、巯基衍生剂(NEM)均能不同程度抑制酶活性,巯基保护剂(DTT)能够使酶活受抑制情况减弱,推测这三种酶中均可能含有可恢复的半胱氨酸活性位点。(2)通过SDS-PAGE凝胶电泳和圆二色谱(CD)研究了三种酶活性抑制与酶蛋白结构的关系。HS处理过的蒜酶和L-乳酸脱氢酶酶蛋白分子量改变不明显,排除了HS是通过形成蛋白分子间的二硫键或者三硫键的方式抑制酶活;借助紫外可见吸收光谱得出了NaS、NaHS、KS溶液中KS含有最多的硫烷硫(Sn);利用CD表明三种酶control组的蛋白具有最高含量的α-螺旋结构及最低的β-折叠结构,随着硫烷硫(S)含量的增多,对应处理组中酶蛋白α-螺旋结构含量下降,β-折叠结构含量升高。再次揭示PS具有最强的半胱氨酸巯基作用力,导致蛋白二级结构的改变。(3)利用MALDI-TOF-MS/MS验证HS是否通过硫烷硫的方式对蒜酶和L-乳酸脱氢酶半胱氨酸巯基衍生形成分子内二硫键。MS/MS结果得出HS抑制蒜酶及L-乳酸脱氢酶酶活是通过对酶蛋白上部分半胱氨酸巯基活性位点硫烷化进行相互作用的。

关键词：硫化氢蒜酶乳酸脱氢酶半胱氨酸巯基硫烷化

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