检索结果-南通市图书馆

代谢型谷氨酸受体组成性活性突变体的构建和功能检测

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

代谢型谷氨酸受体组成性活性突变体的构建和功能检测

作者：肖胜杰华中科技大学

学位级别：硕士

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋性突触神经递质,通过与谷氨酸受体(glutamate receptor, GluR)结合而发挥其生物学功能。在哺乳动物神经细胞中存在两类谷氨酸受体，离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体，其中代谢型谷氨酸... 详细信息

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋性突触神经递质,通过与谷氨酸受体(glutamate receptor, GluR)结合而发挥其生物学功能。在哺乳动物神经细胞中存在两类谷氨酸受体，离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体，其中代谢型谷氨酸受体属于G蛋白偶联受体，在中枢神经系统中起调节突触传递和神经元兴奋性作用，广泛参与学习、记忆及神经系统退行性疾病等多种生理病理过程。mGluR在体内受到非常精密的调控，其过度激活或抑制都会引起各种神经性疾病，因此，研究mGluR的组成性激活并筛选出mGluR组成性活性突变体为进一步的GPCR激活机制研究、调控和药物筛选创造了条件。本研究基于mGluR的半胱氨酸富集区(cysteine rich domain, CRD)与该受体的激活有直接联系，研究证实，mGluR的CRD区存在的四对二硫键是该受体VFT区和HD区之间变构偶联所必须的，同时mGluR2二聚体CRD区半胱氨酸形成的二硫键断裂或重新生成可导致受体的组成性激活。本研究通过生物信息学预测其它亚型mGluR的二硫键分布，在其它亚型mGluR的CRD区引入突变位点得到14个突变体，通过分子生物学检验，本研究构建的14个mGluR突变体均能够正确表达。同时，ELISA实验结果显示，除mGluR1C524A外，其它13个mGluR突变体均能够在细胞膜上表达。在IP3功能检测中，没有配体(Glutamate)结合的mGluR4C502A等10个突变体的IP3积累量和激活后的野生型mGluR的IP3积累量相差不明显。本研究结果显示，mGluR4、mGluR5、mGluR6、mGluR7、mGluR8与mGluR2的CRD区具有类似的结构和激活机制， mGluR1的CRD区虽然在序列上和其他亚型非常接近，但其结构和功能存在较大差异。mGluR4C502A、mGluR4H523C、mGluR5C512A、 mGluR5T533C、 mGluR6C512A、 mGluR6H533C、 mGluR7C523A、mGluR7T544C、mGluR8C516A、mGluR8H537C具有组成性活性。本研究为全面揭示不同亚型mGluRs的激活机制奠定了基础，同时有助于后期药物筛选模型的构建，可为高效反向变构剂的筛选提供条件。

关键词：代谢性谷氨酸受体半胱氨酸富集区组成性活性反向变构剂药物筛选 G蛋白偶联受体

HIV-1 Tat移位突变体的构建及其表达纯化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

HIV-1 Tat移位突变体的构建及其表达纯化

作者：李存枚安徽医科大学

学位级别：硕士

近年来,HIV感染在全球呈迅猛上升趋势,现已成为危害人类健康最严重的传染病之一。现有的抗病毒药物都不能根治艾滋病,为降低感染者的发病率以避免更多的人感染HIV病毒,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。 HIV分为1型和2型,其... 详细信息

近年来,HIV感染在全球呈迅猛上升趋势,现已成为危害人类健康最严重的传染病之一。现有的抗病毒药物都不能根治艾滋病,为降低感染者的发病率以避免更多的人感染HIV病毒,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。 HIV分为1型和2型,其中HIV-1目前流行最为广泛。Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA转录的反式激活因子,是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子,在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。完整的Tat蛋白含有6个功能区:N端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-48aa)、碱性氨基酸富集区(49-59aa)、谷氨酰胺富集区(60-72aa)以及C端区(73-102aa)。在HIV-1感染者中,Tat抗体的出现与艾滋病的发病呈明显的负相关,可使HIV-1血清阳性感染者长期不发病。Tat蛋白所诱导的中和抗体能在体外试验和动物体内抑制病毒的复制和疾病的产生。在HIV Tat疫苗的研究上,本实验室已构建的缺失半胱氨酸富集区的PET32a-Tat(△C)蛋白明显提高了Tat蛋白的原核表达水平和分子稳定性,同时较好地保留了其免疫原性,但是免疫小鼠后产生的抗体效价不高,对Tat分子的一级结构进行改造是获得高效新免疫原的有效途径,对制备预防性和治疗性的Tat疫苗的具有重要意义。本研究分以下三部分进行: 一.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区C端移位突变体的构建,原核表达及免疫原性分析 Tat蛋白的C端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,半胱氨酸富集区有7个保守的半胱氨酸(C22、C25、C27、C30、C31、C34和C37),具有多种细胞外作用,还具有免疫自佐剂功能,用PCR拼接的方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至Tat基因的3′末端,获得其突变体序列(Tat-cct DNA),并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,并转入大肠杆菌*** BL21(DE3)中进行诱导表达出相对分子量为31 000的蛋白,并用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白,纯化后目的蛋白浓度为3.46g/L。pET32a-Tat-cct蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1 600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白(1-101 aa)均呈特异性结合二.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建,原核表达和免疫原性分析 Tat蛋白的N端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,应用PCR的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN) DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌*** BL21(DE3)中进行诱导表达出相对分子量为31000的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化其浓度为5.17 g/L,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA和Western-blot进行鉴定。间接的ELISA和Western-blot结果表明, pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。三.HIV-1型HXB2株蛋白酶的重组蛋白的构建及其在大肠杆菌中的表达 HIV Tat的半胱氨酸富集区具有特殊的结构和免疫自佐剂功能,人类免疫缺陷病毒蛋白酶PR,在HIV生命周期中具有极其重要的作用, PR是HIV复制所必需的酶,应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64-111位核苷酸,22-37位氨基酸)移位至HIV蛋白酶PR的C末端,获得其突变体序列(PR(CC) DNA),构建其原核表达质粒pET32a-PR(CC),并转入大肠杆菌*** BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE电泳显示纯化后pET32a-PR(CC)融合蛋白(4.32 g/l)的相对分子质量约为31600,为HIV-1 Tat疫苗的研究提供了一种可能的新型免疫原。本研究从横向和纵向对HIV-1 Tat的半胱氨酸富集区进行研究,成功构建及表达半胱氨酸富集区的Tat蛋白的C端区和N端区的移位突变体,并保留了免疫原性,为进一步研究高效价的抗体打下了基础;成功构建了PR融合蛋白的原核表达质粒pET32a-PR(CC),为Tat蛋白结构和功能的进一步研究提供了新的模式,为开发HIV Tat疫苗提供一种新型免疫原。

关键词：人类免疫缺陷病毒I型 Tat蛋白半胱氨酸富集区 PR蛋白

新型B淋巴细胞阻断剂（TACI）的蛋白质工程

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

新型B淋巴细胞阻断剂（TACI）的蛋白质工程

作者：王瑞复旦大学

学位级别：硕士

B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）,又称肿瘤坏死因子家族的B细胞活化分子（B cell-activating factor belonged to TNF family, BAFF）是一重要的肿瘤坏死因子超家族成员。增值诱导配体（APRIL,又叫TALL-2、TRDL-1及TNFSF-13）与BAFF的蛋白序列具有33%的同源性。穿膜蛋白活化物（transmembrane activator and CAML interactor, TACI）和B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen, BCMA）是APRIL和BAFF共同的受体。本文中我们进行了人TACI胞外区功能域CRD2基因的克隆,基于受体和Fc的晶体结构,通过计算机模拟技术、分子对接方法,构建了人双受体融合基因酵母表达载体-pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFc,实现了重组CRD2-TACI-Fc融合蛋白的诱导表达、纯化后进行了生物学活性的鉴定。旨在为进一步研究BLyS/APRIL与其受体的相互作用模式和开发用于治疗自身免疫疾病的BLyS/APRIL拮抗剂奠定基础。该项研究取得的主要结果如下：（1）经PCR成功克隆了编码人TACI的胞外段功能域CRD2基因,测序结果与GenBank结果一致。（2）扩增的TACI胞外区功能域CRD2与TACI-Fc段基因连接后插入真核表达质粒pPIC9K,成功地构建了重组真核表达质粒pPIC9K-CRD2-TACI-IgGFc。（3）上述质粒转化毕赤酵母GS115。经甲醇诱导,并优化诱导条件,获得了较高水平的表达。SDS-PAGE分析可见,在46kDa处有目的条带。Western Blot结果表明该蛋白与抗TACI抗体显阳性反应。蛋白序列的质谱分析结果表明,该重组蛋白的一级结构与所设计的DNA序列编码的氨基酸序列一致。ProteinA亲和层析柱进行纯化,得到高纯度的融合蛋白CRD2-TACI-Fc。（4）纯化的融合蛋白进行CCK-8检测,结果表明CRD2-TACI-Fc和TACI-Fc融合蛋白可以阻断APRIL对Raji B细胞系的促增殖作用,并且CRD2-TACI-Fc较TACI-Fc的阻断作用强。本项研究为进一步探讨SLE等自身免疫疾病的发病机制和生物学治疗方法奠定了基础。

关键词：跨膜蛋白复合物增值诱导配体自身免疫性疾病半胱氨酸富集区

阿尔茨海默病脑内p75神经营养因子受体（p75NTR）的表达及Aβ结合位点的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

阿尔茨海默病脑内p75神经营养因子受体（p75NTR）的表达及Aβ结合...

作者：王叶冉第三军医大学

学位级别：硕士

背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是老年人最常见的一种痴呆类型，是以β淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)异常沉积形成老年斑（senile plaques, SP）、过度磷酸化的Tau形成神经纤维缠结、皮层及海马神经元（尤其是... 详细信息

背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是老年人最常见的一种痴呆类型，是以β淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)异常沉积形成老年斑（senile plaques, SP）、过度磷酸化的Tau形成神经纤维缠结、皮层及海马神经元（尤其是基底前脑胆碱能神经元(basalforebrain cholinergic neurons，cBF)）丢失为主要病理改变的中枢神经系统（CentralNervous System，CNS）变性疾病，临床上主要表现为进行性认知功能（以记忆力为主）下降。Aβ是AD的主要致病物质。它的异常折叠和沉积形成老年斑，是AD的重要病理标志之一。p75神经营养因子受体（p75neurotrophin receptor, p75NTR）最早被人们发现是一种神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体，目前研究发现p75NTR是一种泛神经营养因子受体，它不仅可以与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、NGF、神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT-3)、神经生长因子4/5(Neurotrophin-4/5,NT-4/5)等神经营养因子结合，还可与这些神经营养因子的前体结合，完成神经营养因子信号通路的传导，是神经系统发生发育过程中调控存活与凋亡的重要分子。在生理状态下成年人脑内p75NTR主要表达于基底前脑胆碱能神经元及颅内血管壁的神经纤维上，并且表达水平很低，但在AD等病理条件下也表达于其他受影响的神经元，这与Aβ在脑内沉积的部位一致。研究发现，p75NTR也可与Aβ结合并介导其神经毒性作用，从而引起神经元的轴突变性和死亡[1]。我们的前期研究发现，p75NTR在APPswe/PS1dE9小鼠脑内表达增高，并参与了Aβ产生及沉积的调控[2]。但目前尚不清楚AD患者脑内p75NTR表达水平是否发生改变，p75NTR是否参与老年斑的形成，以及p75NTR与Aβ有无特异结合部位。为此，我们针对以下两个问题进行了探讨：（1）以人脑及小鼠脑组织为研究对象，检测AD患者及AD小鼠脑内p75NTR的表达水平及p75NTR与老年斑的空间位置关系;（2）采用ThT荧光分析及免疫共沉淀探究p75NTR与Aβ的特异性结合位点。材料和方法 1.采用Western Blot方法分析AD患者及健康对照脑组织、AD小鼠及同窝野生型小鼠脑组织中p75NTR的表达水平，同时采用免疫组织化学方法对两组研究对象脑内p75NTR的分布及其与老年斑的空间位置关系进行分析。 2.采用ThT荧光分析方法研究包含p75NTR胞外段四个半胱氨酸富集区（CysteineRich Domains,CRDs）的CRD1-2、CRD2-3、CRD3-4片段及p75NTR-ECD全长对Aβ聚集的影响，同时采用免疫共沉淀方法研究p75NTR的CRD1、CRD2、CRD3、CRD4片段及p75NTR-ECD全长与Aβ的结合位点。结果 1.通过对AD患者及健康对照、AD小鼠及同窝野生型小鼠脑组织内p75NTR的表达水平及空间分布进行分析，发现AD脑内p75NTR的表达上调，并且p75NTR阳性的神经纤维位于老年斑的中心部位。 2.通过对Aβ与p75NTR相互结合位点的研究，发现p75NTR胞外段的CRD2、CRD4结构域可与Aβ特异性结合。结论 1. AD脑内p75NTR的表达增高，p75NTR阳性神经纤维位于老年斑的中心部位，提示p75NTR可能参与了AD脑内老年斑的形成。 2. p75NTR胞外段四个半胱氨酸富集区中的第二个（CRD2）和第四个(CRD4)是Aβ的结合位点，有望成为AD的防治靶点。

关键词：阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白老年斑 p75神经营养因子受体半胱氨酸富集区