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Chemical proteomics:terra incognita for novel drug target profiling

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Chinese Journal of Cancer 2012年第11期31卷 507-518页

作者： Fuqiang Huang Boya Zhang Shengtao Zhou Xia Zhao Ce Bian Yuquan Wei The State Key Laboratory of Biotherapy West China HospitalSichuan UniversityChengduSichuan 610041P.R.China Department of Gynecology and Obstetrics West China Second HospitalSichuan UniversityChengduSichuan 610041P.R.China.

The growing demand for new therapeutic strategies in the medical and pharmaceutic fields has resulted in a pressing need for novel druggable targets.Paradoxically,however,the targets of certain drugs that are already widely used in clinical practice have largely not been annotated.Because the pharmacologic effects of a drug can only be appreciated when its interactions with cellular components are clearly delineated,an integrated deconvolution of drug-target interactions for each drug is necessary.The emerging field of chemical proteomics represents a powerful mass spectrometry(MS)-based affinity chromatography approach for identifying proteome-wide small molecule-protein interactions and mapping these interactions to signaling and metabolic pathways.This technique could comprehensively characterize drug targets,profile the toxicity of known drugs,and identify possible off-target activities.With the use of this technique,candidate drug molecules could be optimized,and predictable side effects might consequently be avoided.Herein,we provide a holistic overview of the major chemical proteomic approaches and highlight recent advances in this area as well as its potential applications in drug discovery.

关键词：化学蛋白质组学药物靶标蛋白质相互作用临床实践药理作用细胞成分亲和层析代谢途径

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化学蛋白质组学与药物靶点的发现

药学学报 2011年第8期46卷 877-882页

作者：杨红芹李学军北京大学基础医学院药理学系北京100191 保山中医药高等专科学校云南保山678000

小分子药物靶点的发现对于生物和医学的研究者而言,是一项既重要又艰巨的任务,医学和药学界研究工作者急切需要发现和确认新的靶点。为了克服药物靶点确认的瓶颈,已经发展了许多新技术用以研究小分子化合物与蛋白质分子间的相互作用,其... 详细信息

小分子药物靶点的发现对于生物和医学的研究者而言,是一项既重要又艰巨的任务,医学和药学界研究工作者急切需要发现和确认新的靶点。为了克服药物靶点确认的瓶颈,已经发展了许多新技术用以研究小分子化合物与蛋白质分子间的相互作用,其中包括化学蛋白质组学方法。化学蛋白质组是全蛋白质组学研究的一个亚类,化学蛋白质组学是利用能够与靶蛋白质发生特异性相互作用的化学小分子来干扰和探测蛋白质组,在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能以及蛋白质与化学小分子的相互作用,从而准确找到药物作用靶点的组学研究方法。化学蛋白质组学技术和方法不断成熟,在药物作用靶点的发现、确认和药物多靶点研究等方面都将起到重要的作用,并将大大提高药物发现的效率。

关键词：化学蛋白质组学小分子药物靶点药物发现

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基于化学蛋白质组学的药物靶标鉴定

色谱 2020年第8期38卷 877-879页

作者：宫莉康经武生命有机化学国家重点实验室中国科学院上海有机化学研究所分子合成科学卓越创新中心上海200032 中国科学院大学北京100049

通过药物靶标鉴定,可以建立药物活性与细胞表型之间的联系,阐明药物的作用机理,还可以发现药物的脱靶效应和耐药性机制,发现治疗药物的新靶点,并在药物开发的早期阶段预测可能存在的毒性,降低药物研发失败的风险。目前虽然科学技术取得... 详细信息

通过药物靶标鉴定,可以建立药物活性与细胞表型之间的联系,阐明药物的作用机理,还可以发现药物的脱靶效应和耐药性机制,发现治疗药物的新靶点,并在药物开发的早期阶段预测可能存在的毒性,降低药物研发失败的风险。目前虽然科学技术取得了飞速发展,但是鉴定药物靶标依然是一件令人生畏的工作。本文对近10年来药物靶标鉴定方面的研究进展,特别是无化学标记的新技术进行了评述。

关键词：药物靶标鉴定化学蛋白质组学综述

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定量工程生物学的化学蛋白质组学支撑性技术

科学通报 2021年第3期66卷 356-366页

作者：王蕾黄建东杨舒心黄术强李楠中国科学院深圳先进技术研究院深圳合成生物创新研究院中国科学院定量工程生物学重点实验室广东省合成基因组学重点实验室深圳518055 中国科学院大学北京100049

定量工程生物学是一门前沿交叉学科,通过设计-合成-测试-学习-再设计路线将不同的生物元器件组合,形成可以执行特定功能的基因线路,再经过不断优化获得稳定的、可控的基因线路,最后将设计优化后的线路引入不同的生命体,以达到预设的目的... 详细信息

定量工程生物学是一门前沿交叉学科,通过设计-合成-测试-学习-再设计路线将不同的生物元器件组合,形成可以执行特定功能的基因线路,再经过不断优化获得稳定的、可控的基因线路,最后将设计优化后的线路引入不同的生命体,以达到预设的目的.这种变革性的方法可以创建一些能够灵敏感知和响应各种环境的工程系统,但在其中的功能检测环节,化学蛋白质组学技术则成为了测试工程改造生物功能和探究其作用机制的重要工具.随着以非天然氨基酸嵌入、生物正交化学、高分辨率质谱等技术为手段的化学蛋白质组学方法的发展,在复杂环境中解析工程生物的蛋白质组时空动力学变化成为可能,为探究工程改造菌或工程改造细胞的工作原理及其在生物体内的作用机制提供了必要的技术支撑,也为定量工程生物学研究中所需的深度功能测试提供了有效方法.本文主要是概述化学蛋白质组学技术在定量工程生物学研究中的潜在应用.

关键词：定量工程生物学基因线路化学蛋白质组学生物正交化学

化学蛋白质组学鉴定天然产物作用靶标的研究进展

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天然产物研究与开发 2020年第1期32卷 144-152页

作者：王平罗佳李海舟许敏昆明理工大学生命科学与技术学院

活性天然产物的作用靶标、具体作用机制难以确定,阻碍了其在新药研发方面的发展。化学蛋白质组学,特别是基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP),经过近年的发展,已成为较为成熟的鉴定天然产物作用靶标的... 详细信息

活性天然产物的作用靶标、具体作用机制难以确定,阻碍了其在新药研发方面的发展。化学蛋白质组学,特别是基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP),经过近年的发展,已成为较为成熟的鉴定天然产物作用靶标的方法。本文主要以天然产物结构进行分类介绍了基于亲和性蛋白组学分析方法(affinity-based protein profiling,ABPP)在天然产物作用靶标鉴定方面的应用,并讨论了各种探针设计的应用范围以及优缺点,且对ABPP方法的发展应用和其他靶标蛋白鉴定方法进行展望。

关键词：天然产物化学蛋白质组学 ABPP 靶标鉴定

基于定量化学蛋白质组学研究甘草次酸治疗肺癌的靶点和机制

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基于定量化学蛋白质组学研究甘草次酸治疗肺癌的靶点和机制

作者：赵明洪赣南医学院

学位级别：硕士

目的:肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤,具有高发病率和高死亡率,已经成为全球癌症的主要死亡原因。随着诊疗技术的进步肺癌的治疗趋向于精准化模式,其中基于免疫疗法的各种靶向治疗获得了重大的进步。表皮生长因子受体(Epit... 详细信息

目的:肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤,具有高发病率和高死亡率,已经成为全球癌症的主要死亡原因。随着诊疗技术的进步肺癌的治疗趋向于精准化模式,其中基于免疫疗法的各种靶向治疗获得了重大的进步。表皮生长因子受体(Epithelial growth factorreceptor,EGFR)抑制剂包括吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼等在非小细胞肺癌的治疗上取得了较好的疗效,但这些药物的耐药性限制了药物的长期治疗效果。因此,开发新的肺癌治疗药物改善肺癌患者的治疗效果至关重要。甘草次酸是从甘草中分离提取的五环三萜类天然化合物,对肺癌有着明显的抗癌活性,但其作用靶点和机制尚不明确。因此,本研究基于活性的蛋白质组分析技术(Activity-based protein profiling,ABPP)寻找甘草次酸治疗肺癌的具体蛋白靶点,探究其药理作用的分子机制。为药物的临床应用和新药的开发提供实验参考。方法:1.采用CCK8方法检测甘草次酸对不同肺癌细胞系的增殖的影响。2.采用流式细胞术检测甘草次酸对LLC细胞(小鼠Lewis肺癌细胞)凋亡的影响。3.采用激光共聚焦荧光成像和流式细胞术检测甘草次酸对LLC细胞内ROS(Reactive oxygen species,ROS)和Ca浓度的影响。4.采用点击化学反应(Click-chemistry reaction)和凝胶电泳,检测甘草次酸能否占据炔基碘乙酰胺(IAA)探针在LLC细胞内的蛋白结合位点。5.采用串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)结合液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)技术对甘草次酸在LLC活细胞中直接作用的靶标蛋白进行定量分析和鉴定,并结合生信分析探究甘草次酸治疗肺癌的高可信度靶标蛋白和对所有靶标蛋白进行生物学功能分析。6.使用点击化学技术对重组鼠源Casp3和Prdx6蛋白进行IAA探针和甘草次酸的标记和竞争实验。7.采用荧光共定位成像探究甘草次酸能否竞争掉IAA探针在LLC细胞中占据的蛋白位点。8.采用分子对接技术探究甘草次酸与Casp3和Prdx6蛋白的具体结合位点和结合稳定性。9.采用流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜成像技术检测加入Casp3抑制剂后甘草次酸对LLC细胞凋亡,线粒体膜电位,细胞内ROS的影响。10.构建小鼠原位肺癌模型,采用小动物成像检测甘草次酸对体内肺癌的影响。11.采用LC-MS/MS技术分析甘草次酸给药组和模型组的小鼠肺癌组织差异蛋白表达谱。结果:1.甘草次酸对肺癌细胞生长抑制作用明显,甘草次酸处理24 h后对LLC细胞IC值为28.79μM,对Calu-1细胞IC值为29.72μM,对A549细胞IC值为30.10μM。2.甘草次酸能诱导LLC细胞凋亡,在甘草次酸10μM组和20μM组对LLC细胞的凋亡率分别为19.38%和86.76%(P蛋白的结合位点。5.ABPP技术和生物信息学分析鉴定出了甘草次酸直接作用的靶标蛋白Prdx6和Casp3,所有靶标蛋白主要参与内质网应激、细胞凋亡和线粒体膜通透性调节等通路。6.甘草次酸能浓度依赖性的占据IAA探针在Casp3和Prdx6蛋白上的结合位点。7.甘草次酸能有效竞争掉IAA探针在LLC活细胞中占据的蛋白位点。8.甘草次酸与Casp3和Prdx6蛋白能形成稳定的结合能。9.加入Casp3抑制剂后减缓了甘草次酸促进LLC细胞凋亡、线粒体膜电位下降以及细胞内ROS积聚的效果(P蛋白表达量明显发生改变,其中代谢通路富集在细胞内氧化应激、线粒体能量代谢和细胞凋亡等通路。结论:甘草次酸通过线粒体凋亡途径靶向Prdx6和Casp3,上调ROS水平,促进氧化损伤,导致NSCLC细胞凋亡。

关键词：甘草次酸肺癌化学蛋白质组学细胞凋亡 Ca2+ ROS Casp3 Prdx6

基于定量化学蛋白质组学研究索法酮治疗炎症性肠病的靶点和机制

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基于定量化学蛋白质组学研究索法酮治疗炎症性肠病的靶点和机制

作者：杨通赣南医学院

学位级别：硕士

目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性复发性肠道炎性疾病,很难彻底根治,并且有潜在的癌变风险。在过去十年中,IBD的患病率急剧上升,已成为全球的公共卫生问题。近年来研究表明,炎症反应是IBD发病的关键。临床常... 详细信息

目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性复发性肠道炎性疾病,很难彻底根治,并且有潜在的癌变风险。在过去十年中,IBD的患病率急剧上升,已成为全球的公共卫生问题。近年来研究表明,炎症反应是IBD发病的关键。临床常用的治疗IBD的抗炎药物在远期治疗效果上的不理想,并且与副作用明显。因此,寻找一种毒副作用小、疗效稳定的抗炎药物具有非常重要的临床意义。索法酮(Sofalcone,Sof)是从中国传统植物广豆根中分离得到的一种重要衍生化合物,临床前研究表明其对IBD具有显著的抗炎效果,但其具体机制不明确。本研究拟采用基于活性的蛋白质谱学(Aactivity-Based Protein Profiling,ABPP)方法从“靶点-结合位点-信号通路-整体功效”角度深入揭示Sofalcone治疗IBD的直接结合靶点和分子机制,从靶点源头上诠释其抗炎作用的现代科学内涵,将其临床疗效与药理机制联系起来,从分子水平阐明其作用机制,对于索法酮的现代药理学具有重要的意义。方法：1.采用免疫印迹(Western Blot,WB)实验确认脂多糖(LPS)诱导Caco-2细胞建立IBD体外细胞模型的浓度和时间条件,通过化学试剂盒检测Caco-2细胞的一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)释放量,并通过WB实验测定炎症因子表达量评估索法酮的抗炎效果。2.使用核磁共振(1H-NMR)以及高分辨率质谱(HRMS)对合成的索法酮探针进行表征,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法确认Sof与合成的索法酮探针(Sof-P)的总体细胞效应,同时采用WB实验比较Sof与Sof-P的抗炎活性。3.采用点击化学(Click-chemistry reaction)结合SDS-PAGE凝胶电泳的实验方法,研究Sof-P对Caco-2细胞蛋白的标记效率并验证是否与Sof竞争性结合相同蛋白。同时使用点击化学结合免疫荧光(IF)的实验方法考察Sof-P在Caco-2细胞内的分布。4.采用Pull-down结合生物素富集实验,并通过基于串联质谱标签(TMT)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对富集蛋白进行定量分析及鉴定。对鉴定靶标进行差异化分析并结合使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析方法对高可信度靶标蛋白进行富集分析,分析Sof发挥抗炎作用的可能靶标蛋白。5.基于分析结果,对可信度较高的HMGB1蛋白进行验证。使用Pull-down和WB实验研究Sof是否可以与Sof-P竞争性结合HMGB1蛋白。采用细胞热位移实验(CETSA)研究Sof是否可以增强HMGB1的热稳定性。6.采用重组人HMGB1蛋白、HMGB1 A box和B box蛋白,分别使用微尺度热泳(MST)和紫外可见分光光度方法研究Sof与HMGB1蛋白的结合亲和力以及结合性质。结合使用点击化学和SDS-PAGE荧光成像的实验方法,研究Sof是否共价结合HMGB1的半胱氨酸(Cys)残基位点。同时使用分子对接研究Sof与HMGB1的结合位点。7.采用WB研究Sof对Caco-2细胞中HMGB1的表达的影响,并结合免疫沉淀(IP)研究Sof是否通过结合HMGB1的半胱氨酸,减少B box与Toll样受体4(TLR4)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的结合进而抑制HMGB1的促炎活性。8.使用IF研究Sof对LPS诱导的Caco-2细胞中NF-κB信号通路的影响。通过小RNA干扰实验(si RNA)敲低Caco-2细胞的HMGB1,并结合WB实验研究Sof是否通过抑制HMGB1而发挥抗炎效果。结果：1.浓度为10μg/m L的LPS作用6 h可以有效诱导Caco-2细胞的炎症状态。低浓度(12.5μM)的Sof即可有效抑制炎症状态下Caco-2细胞中NO和ROS的产生释放,同时有效抑制Caco-2细胞炎症因子(白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β))的表达。2.成功合成基于Sof母体结构的携带炔基标签的Sof-P。Sof与Sof-P对Caco-2细胞均表现出较低的细胞毒性(P value>0.05),且都可以有效抑制炎症状态下Caco-2细胞炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)的表达。因此合成的Sof-P与Sof原药具有等效性,可以替代Sof原药用于后续研究。3.Sof-P可以进入Caco-2细胞内并能够呈浓度依赖性的标记其蛋白,且Sof-P结合的大部分蛋白同时能被原药竞争掉。4.通过LC-MS/MS成功鉴定出与Sof-P相互作用的靶标蛋白共337个,其中具有较高可信度的靶点蛋白72个。KEGG通路富集分析显示Sof-P的靶标主要集中在细胞应对细菌感染的炎症反应通路。5.选取可信度较高且在IBD发病中具有重要作用的HMG

关键词：炎症性肠病索法酮化学蛋白质组学 HMGB1 共价靶点

利用化学蛋白质组学方法定量研究人类细胞中的UTP结合蛋白

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利用化学蛋白质组学方法定量研究人类细胞中的UTP结合蛋白

作者：刘云铭湖南大学

学位级别：硕士

核苷酸结合蛋白在多种生物学过程中发挥重要作用。尽管ATP结合蛋白和GTP结合蛋白已经得到了较好的研究,但在整个蛋白质组水平上对UTP结合蛋白进行系统的研究仍存在很大的挑战。本文中,我们发展了UTP探针,并结合基于细胞培养条件下稳定... 详细信息

核苷酸结合蛋白在多种生物学过程中发挥重要作用。尽管ATP结合蛋白和GTP结合蛋白已经得到了较好的研究,但在整个蛋白质组水平上对UTP结合蛋白进行系统的研究仍存在很大的挑战。本文中,我们发展了UTP探针,并结合基于细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的定量蛋白质组学策略对HEK 293T细胞中的UTP结合蛋白进行了鉴定和定量评估。本文主要的研究内容概括如下:(1)UTP探针的合成、表征及反应性检测。首先,将生物素化氨基酸前体与UTP进行偶联以合成UTP探针,然后用高效液相色谱对产物进行分离。进行表征后,将UTP探针与赖氨酸一起孵育以检测其反应性。结果表明UTP探针可以共价标记UTP结合蛋白,说明其与赖氨酸具有高反应性。(2)用基于低/高浓度UTP探针的竞争策略结合基于SILAC的定量蛋白质组学策略鉴定潜在UTP结合蛋白。利用特异性蛋白与探针的结合不依赖于浓度变化的特征,从HEK 293T细胞裂解物中总共鉴定出172种蛋白质,并得到了部分生物素标记肽的信息。以R蛋白确定为潜在UTP结合蛋白,并且发现里面包括一些已知的UTP结合蛋白,例如热休克蛋白HSP90。这些结果表明我们的方法在鉴定UTP结合蛋白方面具有良好的能力。(3)用基于UTP/UTP探针的竞争策略结合基于SILAC的定量蛋白质组学策略进一步对靶蛋白的特异性进行评估。使用母体化合物UTP作为竞争物与UTP探针进行竞争性标记,然后通过质谱鉴定结果对探针的标记效率进行分析。最终总共对303种蛋白进行了定量。按照R蛋白数据。综合分析两次竞争实验的数据,有71种蛋白质同时满足以上两个条件,它们被认为是最有可能的UTP结合蛋白。生物信息学分析表明这些UTP结合蛋白候选者涉及多个生物学过程。综上所述,我们使用特定的生物素化UTP探针结合基于SILAC的定量蛋白质组学工作流程进行了两种类型的竞争实验,鉴定出70多种潜在的UTP结合蛋白。它们参与多种生物学过程,包括翻译延伸、核苷酸结合和蛋白质折叠。对这些UTP结合蛋白的进一步表征将提高我们对UTP在人类细胞中的生物学功能的理解。

关键词：核苷酸结合蛋白 UTP探针质谱化学蛋白质组学 SILAC

人类细胞中CTP结合蛋白的定量化学蛋白质组学研究

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人类细胞中CTP结合蛋白的定量化学蛋白质组学研究

作者：潘梦婷湖南大学

学位级别：硕士

胞苷三磷酸(CTP)是核酸生物合成和蛋白质糖基化所必需的核苷酸。此外,它在膜磷脂合成和细胞信号传递过程中也发挥着至关重要的作用。研究表明CTP在许多生物学过程中都可以作为配体来调节其靶蛋白的活性。但是,在蛋白质组水平上鉴定CTP... 详细信息

胞苷三磷酸(CTP)是核酸生物合成和蛋白质糖基化所必需的核苷酸。此外,它在膜磷脂合成和细胞信号传递过程中也发挥着至关重要的作用。研究表明CTP在许多生物学过程中都可以作为配体来调节其靶蛋白的活性。但是,在蛋白质组水平上鉴定CTP结合蛋白仍然具有挑战性。本研究开发了CTP酰基亲和探针,并结合细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的定量蛋白质组学方法来捕获、鉴定和定量人类细胞中的CTP结合蛋白。本论文研究的主要内容概括如下:(1)CTP酰基亲和探针的设计与合成。基于活性的蛋白质组分析(Activity-based protein profiling,ABPP)具有反映蛋白活性和结合位点的优点。本工作通过简单的两步法合成CTP酰基亲和探针:CTP作为弹头用于结合靶蛋白,γ-氨基丁酸作为中间体减少位阻,生物素作为标签用于亲和纯化。随后通过高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)进行纯化。质谱分析显示产物的质荷比为793.1,与CTP酰基亲和探针一致,证明该探针已成功合成。(2)不同浓度探针结合SILAC技术鉴定CTP结合蛋白。首先,用稳定同位素对HEK 293T细胞进行标记。随后将不同浓度的CTP酰基亲和探针(10μM/100μM)分别与轻标、重标蛋白质组共孵育使探针在天然细胞环境下结合靶标蛋白。孵育完成后利用链霉亲和素凝胶珠下拉带有生物素标签的蛋白,胰蛋白酶消化后进行液相色谱串联质谱(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析。LC-MS/MS共鉴定出575个潜在的CTP结合蛋白,其中包括已知的CTP结合蛋白:CTP合成酶I(CTPS1)和热休克蛋白家族(HSP90s)成员。以上结果证明本方法成功用于CTP结合蛋白的鉴定。(3)游离CTP竞争性实验结合SILAC技术验证CTP结合蛋白。若候选蛋白确为CTP结合蛋白,则CTP的竞争作用会导致探针下拉的蛋白数量减少。基于这一原理,在探针与蛋白组孵育之前加入CTP竞争,再加入探针标记,之后用链霉亲和素纯化,捕获的蛋白消化后进行LC-MS/MS分析。LC-MS/MS共鉴定出129个潜在CTP结合蛋白。结合两组实验数据,我们共鉴定出90个同时满足两种筛选标准的蛋白,我们将其确定为CTP结合蛋白。其中包括部分已知和部分未知CTP结合蛋白。生物信息学分析表明这些CTP结合蛋白参与多种细胞活动,包括蛋白折叠和细胞黏附等过程。本工作为深入研究CTP结合蛋白奠定了基础。

关键词：化学蛋白质组学 CTP结合蛋白 ABPP CTP酰基亲和探针