检索结果-南通市图书馆

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLIII关键位点的结构功能

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与发酵工业 2015年第2期41卷 1-6页

作者：李娟汤斌李松孟庆婷安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

从匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)基因组DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶bgl3全长基因,并在大肠杆菌BL21中实现表达。通过对β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析,确定其与底物作用过程中的关键氨基酸为Trp127。对该位点进行突变研究,结果显... 详细信息

从匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)基因组DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶bgl3全长基因,并在大肠杆菌BL21中实现表达。通过对β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析,确定其与底物作用过程中的关键氨基酸为Trp127。对该位点进行突变研究,结果显示:突变为不带侧链的Ala时,酶活降低20.8%;突变为具有相同苯环侧链的Phe时,酶活相差不大;突变为带有非苯环长链的Leu时,酶活提高34.07%。Leu的长链在维持原有活性中心构象的基础上,与酶解产物葡萄糖的疏水作用增强,从而提高酶与底物结合效率。即127位氨基酸的空间构象对BGLIII活性中心的结构功能有显著影响。

关键词：匍枝根霉 β-葡萄糖苷酶结构与功能突变

匍枝根霉纤维素酶发酵条件优化及分批发酵动力学模型的构建

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与发酵工业 2014年第1期40卷 85-90页

作者：汤斌许钟源李松陈涛安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

以滤纸酶活为检测指标,通过单因素实验和均实验设计优化匍枝根霉产纤维素酶培养条件,并以此为基础进行分批发酵,并利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程构建动力学模型。优化结果表明:滤纸酶活在发酵时间为84 h时达到13.16 IU/mL,比... 详细信息

以滤纸酶活为检测指标,通过单因素实验和均实验设计优化匍枝根霉产纤维素酶培养条件,并以此为基础进行分批发酵,并利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程构建动力学模型。优化结果表明:滤纸酶活在发酵时间为84 h时达到13.16 IU/mL,比优化前提高了149%,其中,内切酶活、外切酶活和β-葡萄糖苷酶活高值分别为45.81 IU/mL、0.537 IU/mL和12.45 IU/mL且所建模型拟合良好。

关键词：匍枝根霉纤维素酶发酵优化动力学模型

匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的初探及结构功能研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国生物工程杂志 2018年第4期38卷 38-45页

作者：张莹莹汤斌堵国成江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 安徽工程大学生物与化学工程学院芜湖241000

纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶,前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS）,可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖,从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究***中纤维二糖的胞... 详细信息

纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶,前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶（CBS）,可以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖,从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究***中纤维二糖的胞内合成途径,通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptr A,分别转化原菌TP-02和△ugp突变株,构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用（LC-MS）检测突变株的胞内糖组分,发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱,但同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-q PCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右,而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究,发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示,UDPG为***胞内合成纤维二糖的主要糖基供体,而GDPG可能是UDPG的替代物,在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外,利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析,经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300,为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。

关键词：纤维二糖纤维素酶匍枝根霉合成机制

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

匍枝根霉cbh2基因的克隆表达与结构分析

食品与发酵工业 2015年第4期41卷 22-27页

作者：张庆庆谢志皓李松孙全霞汤斌安徽工程大学生物与化学工程学院安徽芜湖241000

采用反向PCR技术从匍枝根霉中克隆cbh2基因,该基因编码440个氨基酸的蛋白质。利用DS2.5软件进行同源模拟和建立分子动力学模型,研究cbh2催化纤维六糖水解过程中结合区（CBM）上的关键位点,催化区（CD）上催化隧道关键位点的相互依赖作用... 详细信息

采用反向PCR技术从匍枝根霉中克隆cbh2基因,该基因编码440个氨基酸的蛋白质。利用DS2.5软件进行同源模拟和建立分子动力学模型,研究cbh2催化纤维六糖水解过程中结合区（CBM）上的关键位点,催化区（CD）上催化隧道关键位点的相互依赖作用,水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖。把cbh2基因与p ET22-b（＋）载体连接,实现了在*** BL21（DE3）中原核表达。通过镍柱层析、DEAE FF层析和G-75层析三步纯化法获得46 k Da的酶蛋白,比活力为4.67 IU/mg。纯化的重组酶具有高水平的催化活性,对微晶纤维素具有较好的水解特性,CBHII酶的Km为7.358（mg/m L）。研究CBHII酶的基本特性,其最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0,CBHII酶在p H 4～7下具有较宽的稳定性,在65℃以下热稳定性较好,在催化过程中保持较高的活力。

关键词：匍枝根霉纤维二糖水解酶克隆表达纯化结构分析

匍枝根霉TP-02内切葡聚糖酶基因eg2的克隆表达及功能分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与发酵工业 2013年第7期39卷 13-17页

作者：汤斌张莹莹杨亚平安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D... 详细信息

从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D及E260D对GH45活性中心的改变较大。突变株的发酵特性显示,N39S可缩短达到峰值的时间,V136D及E260D可显著提高酶活。其中,突变株EGⅡ-F在发酵21 h后,酶活达到最高为1.321 IU/mL,比突变前提高了82.7%。

关键词：匍枝根霉内切葡聚糖酶突变功能分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

匍枝根霉淀粉发酵产纤维素酶的条件研究

食品与发酵工业 2016年第6期42卷 93-97页

作者：周若飞汤斌李松阚清华安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心安徽芜湖241000

以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)为出发菌株,首次利用淀粉水解液为主要碳源,快速合成纤维素酶。从碳源、氮源、培养温度、初始p H、装液量和接种量等方面研究该菌株的产酶条件。获得最佳培养基和培养条件为:10%淀粉水解液,... 详细信息

以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)为出发菌株,首次利用淀粉水解液为主要碳源,快速合成纤维素酶。从碳源、氮源、培养温度、初始p H、装液量和接种量等方面研究该菌株的产酶条件。获得最佳培养基和培养条件为:10%淀粉水解液,麸皮浸出汁5%,NH_4Cl 0.5%,KH_2PO_40.5%,MgSO_4·7H_2O 0.4%,CaCl_20.4%,酵母粉0.6%;发酵温度30℃,装液量80 m L/(250 m L),初始p H 5.0,接种量8%。通过摇瓶实验优化培养基和培养条件后,获得滤纸酶活为9.66 IU/m L。研究中进一步利用该培养基在5 L发酵罐中发酵至60 h时酶活达到最大值,其中滤纸酶活、外切酶活、内切酶活和β-葡萄糖苷酶分别为16.51、15.39、11.48和6.17 IU/m L。与以往纤维素类物质为碳源发酵产纤维素酶相比,淀粉水解液发酵获得的纤维素酶酶系组成有了较大的变化,特别是关键的外切酶活有了大幅度提高,而发酵时间缩短了将近1倍。

关键词：匍枝根霉淀粉水解液发酵纤维素酶

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

匍枝根霉固态发酵产木聚糖酶条件研究

饲料研究 2012年第11期35卷 23-28页

作者：李佳少张志才冯凡刘丹李敏庞巧霞陈克平江苏大学食品与生物工程学院生物工程研究所北京绿科天成生物有限公司江苏大学生命科学研究院

木聚糖酶作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业,因其具有改善消化道功能、降低食糜黏度和抗营养性、提高饲料利用率及减少环境污染等特点而备受关注。试验首先通过单因素试验法得到了最佳的氮源、料液比、无机盐和表面活性剂,为进一步... 详细信息

木聚糖酶作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业,因其具有改善消化道功能、降低食糜黏度和抗营养性、提高饲料利用率及减少环境污染等特点而备受关注。试验首先通过单因素试验法得到了最佳的氮源、料液比、无机盐和表面活性剂,为进一步提高产木聚糖酶的水平,以玉米芯粉为主要基质,采用响应面分析法优化匍枝根霉产木聚糖酶发酵培养基。优化的培养基为尿0.15、ZnSO40.022、Tween-80 0.08及含水量3 g/g干基质(DS),在最佳培养条件下,经7 d发酵酶活达到最大值:13.899 8 U/g DS。

关键词：木聚糖酶匍枝根霉固态发酵优化

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLⅢ结构与功能的研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLⅢ结构与功能的研究

作者：李娟安徽工程大学

学位级别：硕士

纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物：外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶(BGL),三种酶协同作用完成对纤维素的水解。p-葡萄糖苷酶作为纤维素酶水解纤维素过程的限速酶,成为酶解木质纤维素生成生物乙醇的瓶颈。目前,如何提... 详细信息

纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物：外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶(BGL),三种酶协同作用完成对纤维素的水解。p-葡萄糖苷酶作为纤维素酶水解纤维素过程的限速酶,成为酶解木质纤维素生成生物乙醇的瓶颈。目前,如何提高p-葡萄糖苷酶的活力及产量,优化纤维素酶系的构成已成为了研究的一大热点。本文以本实验室从黄山腐木中筛选得到的匍枝根霉TP-02为出发菌株,获取其p-葡萄糖苷酶基因并对关键位点进行改造,纯化获得重组蛋白并研究其酶学性质,结合软件模拟与实验探究p-葡萄糖苷酶的结构与功能,并构建了具有强启动子的匍枝根霉转化子。主要研究内容包括：(1)本研究成功提取了匍枝根霉基因组DNA并且合成了cDNA单链,并从中克隆到一个新p-葡萄糖苷酶基因bgl3(基因登录号为KP115896)。将其连接pET22b载体,转化大肠杆菌BL21,实现p-葡萄糖苷酶的原核表达。发酵结果表明,重组菌在25℃,0.1mmol/L IPTG培养条件下,发酵12h达到酶活最高值,为0.788IU/mL。(2)借助一系列生物信息学软件预测和分析bgl3基因的基本特性、保守功能域等信息。分析结果表明：bgl3基因全长1452 bp,编码484个氨基酸,其基因产物BGⅢ含两个典型的GH1特征序列,归属于糖苷水解酶第1家族。BGⅢ没有典型的跨膜区存在,理论上为可溶性较好的球蛋白。(3)对BGⅢ和GH1序列进行比对分析及结构模拟,利用DS 2.5软件进行了BGLⅢ蛋白的同源建模,并且以纤维二糖为底物进行了分子对接,模拟了酶与底物在活性中心的相互作用过程。结果显示,BGLⅢ三级结构为经典的(α/β)8-TIM桶结构类似,活性位点包含两个关键的谷氨酸残基。纤维二糖模型紧贴着结合口袋壁,深入到结合口袋中,在各关键残基的作用下分解为葡萄糖。根据生物信息学及分子动力学分析结果,确定Trp127为研究重点,并将Trp127突变为不同侧链的Ala, Phe和Leu。Trp位于活性中心一侧,且在活性中心与底物结合过程中扮演重要的角色。Trp127当突变为不带侧链的Ala时,与Glu173空间距离增大,空间位阻发生变化,不能维持糖苷结合位点原有构象,导致酶活大幅度降低;而当突变为具有相同苯环侧链的Phe时,与其他残基氢键及疏水作用力变化不大,进一步证明氨基酸空间构象对底物活性中心的重要性;当突变为具有带有非苯环长链的Leu时,酶活较大提高,可能是由于Leu的长链在维持原有构象的基础上,Tyr315和Glu384与底物空间距离缩短,氢键能量增加,使得水解p-1,4糖苷键作用力增强,同时葡萄糖的疏水作用的增强,进一步提高葡萄糖耐受性。(4)利用重叠PCR完成目的位点的分子改造,成功筛选3株原核重组菌。发酵结果显示pET-22b(+)-W127L在IPTG诱导后12 h酶活达到最好,为1.090 IU/mL,较pET-22b(+)-W127提高了34.07%;对原始重组菌和个突变株的SDS-PAGE结果表明,BGIII的分子量为54kDa。其中pET-22b(+)-W127L的目的条带最粗,表达量较高。(5)分别对各重组蛋白进行纯化和酶学性质分析。BGLⅢ采用亲和层析和离子交换层析进行纯化,获得54 kDa的蛋白。酶学性质分析表明,BGLⅢ最适温度为55℃,并且30℃至60℃之间保持90%以上的酶活力,具有广泛温度适应性。而在70℃以上时,酶活力迅速下降,相对酶活力不到10%。最佳pH值和pH值适应性研究表明,BGLⅢ最适pH值为5.0,并且酶在pH为4至7时,都能保持80%以上的活性。金属离子对BGLⅢ的影响研究表明,Mg2、Mn2+和Fe2+对BGLⅢ活性有促进作用,其中Mg2+增强作用最明显;Hg2+、Ca2+、K+、Cu2+和Zn2+则对BGLⅢ活性有抑制作用,其中,Hg2+和Cu2+比较明显,Cu2+存在时,BGLⅢ活性不到10%,而当Hg2+存在时,BGLⅢ活性完全丧失。(6)以黑曲霉基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶启动子PglaA基因片段。利用重叠PCR方法,将glaA与bgl3连接,构建融合基因glaA-bgl3。为融合基因glaA-bgl3构建同源臂,并添加潮霉素B筛选标记,成功转化匍枝根霉分生孢子。对转化子和出发菌株匍枝根霉TP-02进行发酵实验,结果表明：转化菌的p-葡萄糖苷酶活性相较匍枝根霉TP-02提高了23.9%。在实验研究基础上,结合生物信息学分析,对匍枝根霉p-葡萄糖苷酶BGLⅢ的结构与功能进行了初步分析探讨,构建了原核表达重组菌和匍枝根霉转化子,为匍枝根霉p-葡萄糖苷酶的深入研究提供基础。

关键词：匍枝根霉 β-葡萄糖苷酶结构功能分析定点突变 glaA启动子

匍枝根霉碳代谢调控基因(cre)对纤维素酶表达调控作用的研究

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

匍枝根霉碳代谢调控基因(cre)对纤维素酶表达调控作用的研究

作者：孟庆婷安徽工程大学

学位级别：硕士

纤维素酶是一种复合酶,分解纤维素时起生物催化作用,广泛存在于自然界的生物体内。一般用于生产纤维素酶的菌株主要为丝状真菌,产生外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p一葡萄糖苷酶,三种酶结合正调控和负调控的双重机制调控多种基因的转录... 详细信息

纤维素酶是一种复合酶,分解纤维素时起生物催化作用,广泛存在于自然界的生物体内。一般用于生产纤维素酶的菌株主要为丝状真菌,产生外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p一葡萄糖苷酶,三种酶结合正调控和负调控的双重机制调控多种基因的转录和编码。纤维素酶基因的表达受到碳源的影响,其中葡萄糖可抑制这些基因的表达。CRE蛋白是在丝状真菌中普遍存在的一种碳源代谢抑制因子。目前,解除纤维素酶表达过程中的碳源阻遏效应,提高纤维素酶基因的表达己成为研究的重要趋势。本实验室从黄山生态林中采集并分离出一株高产纤维素酶的匍枝根霉TP-02,以其为出发菌株进行研究。从基因组中扩增得到碳代谢阻遏基因并对其进行生物信息学分析,将潮霉素B基因插入其中,转化获得CRE缺失菌株,并对纤维素酶基因转录调控特性展开研究。主要研究内容包括：(1)根据已经公布的基因序列,设计简并引物,以匍枝根霉TP-02染色体为模板进行扩增,获得1284bp的序列。将克隆得到的基因序列提交NCBI进行核酸比对,比对发现cre基因编码区长1284bp,编码428个氨基酸。与曲霉属cre基因具有较高的同源性。(2)以pRS303H质粒为模板,克隆得到潮霉素B抗性基因hygB片段。根据生物信息学软件分析hygB与cre基因的整合位点并设计引物,克隆了cre上下游同源区序列,潮霉素为筛选标记。利用重叠PCR技术构建融合基因cre-HygB,全长2310bp,并转化匍枝根霉萌发孢子,在潮霉素抗性平板上筛选获得阳性克隆。将筛选获得的分生孢子传代于含有潮霉素的平板,挑选传代10代以上的菌株。(3)提取转化子染色体DNA,利用hygB两段引物扩增抗性基因,验证所筛菌株带有潮霉素抗性基因;利用cre同源区上下游引物扩增全长,目的条带单一,大小一致。PCR验证结果显示,ΔCRE菌株构建成功。进一步验证ΔCRE菌株中外源片段发生同源重组时在染色体中的拷贝数,提取筛选到的5株转化子的总RNA。利用反转录试剂盒合成cDNA单链,以SYBR为荧光染料进行RT-PCR分析。结果显示,有一株未检测到原始菌株cre基因的拷贝数,同源重组成功,获得ΔCRE菌株。(4)为了分析匍枝根霉中cre基因的功能,通过发酵实验对TP-02原始菌株和ACRE突变株进行比较。选取不同浓度碳源进行发酵,2%葡萄糖浓度下,ΔCRE突变株的滤纸酶活相比较匍枝根霉TP-02提高了33%;3%葡萄糖浓度下,突变株的滤纸酶活相较匍枝根霉TP-02提高了21.8%。随着糖浓度的增加,酶活的高峰期出现了滞后现象,表明cre基因的破坏明显削弱了CRE因子对纤维素酶表达的抑制作用。利用RT-PCR对此突变株纤维素酶基因转录水平进行研究,发现eg, bg, cbh1和cbh2的转录均有所提高,分别为48.75%,26%,5.6%和38.6%。匍枝根霉利用葡萄糖产纤维素酶的过程中,三种主要的酶类的合成代谢与糖类物质息息相关。CRE的敲除使得纤维素酶相关基因表达上调,具有调控特异性。培养过程中不同浓度的糖会影响关键酶的产生。菌体中碳代谢阻遏因子CRE的破坏解除其对纤维素酶转录调控的抑制,削弱了纤维素酶生产的碳代谢阻遏效应,使得纤维素酶基因高效表达,提高了纤维素酶的产量,为产业化生产提供了有利保障。

关键词：匍枝根霉碳阻遏因子纤维素酶转录调控