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包皮成纤维细胞的生物学特性研究

重庆医科大学学报 2009年第1期34卷 41-44页

作者：黎晓莉张雁吴宏重庆医科大学干细胞与组织工程研究室组织胚胎学教研室重庆400016

目的：探讨人包皮成纤维细胞的生物学特性，为人胚胎生殖细胞（Human embryonic germ *** cell）长期体外培养打下基础。方法：探索分离包皮成纤维细胞的方法；采用免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术等对人包皮成纤维细胞进行生长形态... 详细信息

目的：探讨人包皮成纤维细胞的生物学特性，为人胚胎生殖细胞（Human embryonic germ *** cell）长期体外培养打下基础。方法：探索分离包皮成纤维细胞的方法；采用免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术等对人包皮成纤维细胞进行生长形态观察，纯度鉴定，生长曲线及细胞周期检测，并就不同浓度丝裂霉素作用不同时间对人包皮成纤维细胞生长的影响进行研究。结果：0．25％胰酶，4℃消化过夜（12～16h）较37℃，5％CO2孵育2h更容易分离表皮和真皮；包皮成纤维细胞波形蛋白染色呈强阳性，纯度达95％以上；细胞生长曲线没有明显的滞留期，在1-6d处于快速增殖期，第7d开始处于平台期；细胞周期大多数处于Go／G，期，细胞周期与细胞生长曲线保持一致。丝裂霉素抑制包皮成纤维细胞增殖的适宜浓度及时间为12．5ug／ml作用2．5h。结论：包皮成纤维细胞的生物学特性表明其可以作为人EG细胞长期体外培养的饲养层。

关键词：生物学特性包皮成纤维细胞饲养层

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人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立

解剖学报 2012年第5期43卷 601-607页

作者：李雪单智焱吴嫣爽申景岭杨玉芝雷蕾哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室哈尔滨150081 黑龙江省医院内分泌科哈尔滨150036

目的探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法。方法利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定最佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制... 详细信息

目的探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法。方法利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定最佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐(VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞。通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达。结果以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达;小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率。结论在GFP所指示的最佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs。

关键词：干细胞分化包皮成纤维细胞绿色荧光蛋白免疫荧光人

包皮成纤维细胞生物学特性研究及以其为饲养层对胚胎生殖细胞生长的影响

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包皮成纤维细胞生物学特性研究及以其为饲养层对胚胎生殖细胞生长...

作者：黎晓莉重庆医科大学

学位级别：硕士

人胚胎多能性干细胞来源于原始生殖嵴(primordial germ cells, PGCs)和囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),具有体外无限增殖能力和发育全能性等特征。PGCs和胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG细胞)作为干细胞之母在发育生物学及生... 详细信息

人胚胎多能性干细胞来源于原始生殖嵴(primordial germ cells, PGCs)和囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),具有体外无限增殖能力和发育全能性等特征。PGCs和胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG细胞)作为干细胞之母在发育生物学及生殖系肿瘤研究等领域有其独特的理论和应用价值。但自1998年美国科学家先后分离得到人EG细胞和人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)以来,人ES细胞的研究热潮远远超过人EG细胞,究其原因为人EG细胞培养条件苛刻,难以获得能长期在体外培养的细胞系。因此优化人EG细胞培养体系必将推动其深入研究。饲养层(feeder cells)是体外成功培养人EG细胞的必要条件,因此寻找适合人EG细胞体外培养的饲养层是人EG细胞成功建系并用于实际的关键。目前在胚胎干细胞的培养及建系过程中通常采用STO细胞系或小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层,但小鼠来源的饲养层细胞可能给培养体系带来异源蛋白和遗传物质及逆转录病毒等,给培养体系造成污染,成为限制胚胎干细胞临床应用的瓶颈。因此,有必要建立人源性的饲养层细胞。胚胎成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫内膜基质细胞等都被采用作为胚胎干细胞体外培养饲养层,但其来源有悖于伦理道德或需经过妇科手术等而受到严格限制。包皮来源广泛,取材方便,国内外已有采用人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF)作饲养层成功培养人ES细胞的报道,但还未见用其作为人EG细胞饲养层的报道。故我们采用包皮成纤维细胞作为人EG细胞体外培养的饲养层,进行了以下研究:1.以包皮环切术后儿童包皮为材料分离、培养、鉴定包皮成纤维细胞,并研究其生物学特性。2.以自行分离培养的包皮成纤维细胞为饲养层,分离培养人EG细胞,并进行鉴定。1.包皮成纤维细胞生物学特性研究目的:研究包皮成纤维细胞生物学特性并检测其分泌物成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)的量。方法:取包皮环切术后儿童包皮分离、培养包皮成纤维细胞,用免疫细胞化学法检测P3代细胞纯度,流式细胞术及MTT法检测P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的细胞周期、生长曲线,MTT法测定不同浓度丝裂霉素C作用不同时间抑制HFF增殖作用及用ELISA法测定P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞上清液中FGF的量。结果:1.包皮成纤维细胞呈贴壁生长,形成漩涡状、栅栏状或放射状有序排列,细胞形态多样。2. P3代细胞波形蛋白染色显示成纤维细胞纯度达到95%以上。3. P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的细胞周期大多数处于G0/G1期,为细胞进入S期做准备。P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的生长曲线显示没有明显的滞留期,在1～6d都处于快速增殖期,第7d开始处于平台期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致。4.丝裂霉素C抑制包皮成纤维细胞增殖的最佳浓度和时间为12.5μg/ml作用2.5h。5. P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞上清液中FGF的量在172.09±2.66 pg/ml～245.25±1.66 pg/ml之间波动。结论:包皮成纤维细胞的生物学特性表明其作为人EG细胞的饲养层是可行的。2.包皮成纤维细胞作为饲养层对人EG细胞生长的影响目的:研究人EG细胞在包皮成纤维细胞饲养层上的生长并进行干细胞生物学鉴定。方法:分离5～11w流产胚胎PGCs,种植在包皮成纤维细胞饲养层上并连续传代,用碱性磷酸酶试剂盒检测其碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学法检测其胚胎表面特异性抗原SSEA-1、SSEA-4的表达,RT-PCR法检测转录因子Oct-4的表达。结果:1.分离培养的人EG细胞具有人胚胎干细胞的典型形态和集落生长特征。2. P3代人EG细胞集落AKP染色呈强阳性。3. P3代人EG细胞集落胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性。4. P3代人EG细胞集落转录因子Oct-4表达阳性。结论:包皮成纤维细胞作为饲养层能支持人EG细胞的生长并维持其未分化状态。综上所述,本实验研究了包皮成纤维细胞生物学特性及人EG细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状况,为人EG细胞的进一步研究进行了有益的探索。

关键词：包皮成纤维细胞饲养层胚胎生殖细胞增殖分化

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用包皮成纤维细胞培养弓形虫速殖子的研究

中国寄生虫病防治杂志 2004年第5期17卷 268-269,F002页

作者：许丽芳杨秋林张愉快梁瑜伍和平南华大学医学院诊断学教研室湖南衡阳421001

目的　建立用包皮成纤维细胞 (Humanforeskinfibroblasts ,HFF)培养弓形虫速殖子的方法。　方法　将包皮环切术切下的包皮在含青、链霉素的Hank’s液中充分洗涤后 ,用眼科剪子剪成 0 .5cm3 的组织小块 ,移入培养瓶中培养 ,待HFF细胞长... 详细信息

目的　建立用包皮成纤维细胞 (Humanforeskinfibroblasts ,HFF)培养弓形虫速殖子的方法。　方法　将包皮环切术切下的包皮在含青、链霉素的Hank’s液中充分洗涤后 ,用眼科剪子剪成 0 .5cm3 的组织小块 ,移入培养瓶中培养 ,待HFF细胞长满瓶底后 ,用胰酶消化并将其接种到培养皿中的盖玻片上培养 ,HFF长满盖玻片后 ,用弓形虫速殖子感染HFF ,镜下观察并于 1、2 .5、4、5 .5、10、2 3和 3 2h取出其中一皿中的盖玻片 ,经姬氏染色、二甲苯透明后 ,镜下观察速殖子生长情况。　结果　弓形虫速殖子大多在感染后 3h～ 5h侵入HFF ,3 2h左右 ,假包囊破裂 ,释放出虫体。　结论　成功建立了用HFF培养弓形虫的方法。

关键词：弓形虫包皮成纤维细胞细胞培养

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不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用

中国医学科学院学报 2009年第4期31卷 468-472,I0004,I0005页

作者：朱宛宛李宁王芳付琳琳徐艳玲关云谦张愚首都医科大学宣武医院老年病研究所细胞治疗室北京100053 教育部神经变性病重点实验室北京100053 首都师范大学生命科学学院生殖与发育研究室北京100037

目的比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异。方法分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台... 详细信息

目的比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异。方法分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定。结果3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大。3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性。MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P细胞均可支持hESC的正常生长。MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础。在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF。

关键词：人胚胎干细胞滋养层包皮成纤维细胞骨髓间充质干细胞

银杏酸、阿奇霉素和大蒜素抗弓形虫增殖效果研究

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中国人兽共患病学报 2008年第8期24卷 736-740页

作者：吴亮陈盛霞姜旭淦周天戟徐会娟帅连云傅行礼曹建平江苏大学医学技术学院镇江212013 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病与媒介生物学重点实验室上海200025

目的评价银杏酸、阿奇霉素和大蒜素体外和体内抗弓形虫增殖的效果。方法体外试验,培养HFF细胞做为弓形虫宿主细胞,采用MTT法检测3种药物的安全浓度和体外抗弓形虫增殖的效果。体内试验,以腹腔注射的方式给药,观察感染弓形虫小鼠的存活时... 详细信息

目的评价银杏酸、阿奇霉素和大蒜素体外和体内抗弓形虫增殖的效果。方法体外试验,培养HFF细胞做为弓形虫宿主细胞,采用MTT法检测3种药物的安全浓度和体外抗弓形虫增殖的效果。体内试验,以腹腔注射的方式给药,观察感染弓形虫小鼠的存活时间,比较3种药物的体内抗弓形虫增殖效果。结果银杏酸和阿奇霉素可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,两者效果相近。银杏酸和阿奇霉素均可延长小鼠存活时间。大蒜素抗弓形虫效果微弱。结论银杏酸具有抗弓形虫作用。

关键词：银杏酸阿奇霉素大蒜素弓形虫包皮成纤维细胞

人胚胎干细胞HuES17向造血干细胞的分化

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中国组织工程研究 2012年第49期16卷 9174-9178页

作者：邢宏运卞铁荣刘霆龚玉萍四川大学华西医院血液内科四川省成都市610041 泸州医学院附属医院血液内科泸州医学院附属医院医学分子实验中心四川省泸州市646000

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES1... 详细信息

背景:人类胚胎干细胞是来源于着床前囊胚的内细胞团,能在长期培养中无限增殖并保持未分化状态,且具有分化成人体组织各种细胞类型能力的细胞。目的:进一步验证人胚胎干细胞HuES17细胞株向造血干细胞分化的能力。方法:人胚胎干细胞HuES17采用与人包皮成纤维细胞二维共培养的方式培养,采用人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养的方法诱导胚胎干细胞向造血干细胞分化。结果与结论:人胚胎干细胞与小鼠骨髓基质细胞(OP9)二维共培养诱导造血分化的第四五天即开始出现OP9细胞逐渐老化,很快死亡;可以观察到人胚胎干细胞分化,然而,随着OP9细胞死亡,分化的人胚胎干细胞亦死亡,不能诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化。提示人胚胎干细胞HuES17细胞株可能不能向造血干细胞分化,或向造血干细胞分化的能力较低。

关键词：人胚胎干细胞造血干细胞诱导分化包皮成纤维细胞骨髓基质细胞干细胞

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人胚胎生殖细胞饲养层的制备

重庆医科大学学报 2011年第12期36卷 1440-1444页

作者：姜蓉黎晓莉吴宏王璐重庆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs)。方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察... 详细信息

目的:建立稳定高效的人包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblasts,HFF)饲养层培养体系,用于培养人胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EGCs)。方法:取4～5岁小儿包皮,采用机械法和组织消化法分离、培养成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞生长状况,免疫细胞化学法、MTT法、流式细胞术检测细胞纯度、生长曲线及细胞周期,筛选丝裂霉素C作用的最佳浓度和时间。分离5～11周人胚胎原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)并培养于经丝裂霉素C处理的HFF饲养层上,观察人EGCs生长情况。结果:机械法和组织消化法结合分离HFF方法可靠,纯度高,细胞生长活性好,能快速进入对数生长期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致,细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;丝裂霉素C抑制细胞增殖的适宜浓度及时间为12.5 mg/L作用2.5 h;分离的人PGCs在该饲养层上培养可形成典型的EGCs集落,体外连续培养超过3代。结论:HFF饲养层能有效地支持人EGCs的生长。

关键词：人胚胎生殖细胞包皮成纤维细胞饲养层

EMT在Mafb敲除致尿道下裂发生机制中的初步研究

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EMT在Mafb敲除致尿道下裂发生机制中的初步研究

作者：刘振忞重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:尿道下裂作为一种最常见的男性外生殖器先天性畸形,发病机制迄今为止仍不明确。Mafb已被证实作为雄激素信号调控蛋白参与尿道形成,Mafb异常表达可能导致尿道下裂发生,相关机制有待进一步研究。目的:利用CRISPR/Cas9技术构建转录因... 详细信息

背景:尿道下裂作为一种最常见的男性外生殖器先天性畸形,发病机制迄今为止仍不明确。Mafb已被证实作为雄激素信号调控蛋白参与尿道形成,Mafb异常表达可能导致尿道下裂发生,相关机制有待进一步研究。目的:利用CRISPR/Cas9技术构建转录因子Mafb基因敲除小鼠,进行繁育鉴定;初步分析其尿道下裂表型;探究Mafb基因敲除或表达被抑制后,对小鼠阴茎尿道发育及包皮成纤维细胞迁徙、上皮间质转化等能力的影响,分析其可能机制。方法:1.构建与繁育Mafb基因敲除小鼠:设计向导RNA(g RNA),利用CRISPR/Cas9技术构建F0代Mafb基因敲除小鼠,通过PCR法及测序鉴定基因型后,选取鉴定阳性F0小鼠使其同野生型C57BL/6J小鼠交配繁殖,进而获得Mafb基因敲除杂合子(Mafb)小鼠;Mafb小鼠间进行交配繁殖,获取Mafb基因敲除纯合子(Mafb)胎鼠;观察Mafb基因敲除小鼠生长繁殖、大体形态学等相关情况。***基因敲除小鼠阴茎组织样本初步观察:麻醉后取妊娠18.5天(GD 18.5)Mafb孕鼠胚胎,经PCR法确定基因型后,观察Mafb小鼠和Mafb小鼠大体形态,免疫荧光验证Mafb胎鼠阴茎组织中Mafb基因表达情况,扫描电子电镜及H-E染色观察阴茎组织形态学变化,免疫荧光检测Mafb胎鼠阴茎组织尿道缝处EMT相关标志物E-cadherin,α-SMA表达。3.细胞实验:应用小干扰RNA(si RNA)针对人包皮成纤维细胞系中Mafb进行靶向转染,成功抑制Mafb表达后,通过对α-SMA,Vimentin的检测,探究Mafb敲除后对包皮成纤维细胞系EMT相关标志物影响;通过划痕实验,观察0h、6h、12h、24h和48h包皮成纤维细胞迁移情况,从而Mafb敲除后对包皮成纤维细胞系迁移能力的影响。结果:1.成功构建、繁育Mafb小鼠,其与WT小鼠相比无明显外观畸形,PCR法成功鉴定基因型。保持种群数量并得到Mafb小鼠,新生鼠出生时正常,但在数分钟内出现发绀并死亡;GD 18.5d的Mafb胎鼠大体形态未发现明显差异。2.免疫荧光检测结果验证Mafb胎鼠的阴茎组织内几乎不存在Mafb蛋白表达,扫描电子显微镜及H-E染色显示Mafb雄性胎鼠为尿道下裂表型,且相较于野生型小鼠其尿道缝处E-cadherin蛋白表达明显降低、α-SMA蛋白表达明显增高。3.使用q PCR检测Mafb-si RNA组与阴性对照(NC)组Mafb基因表达情况,结果表示Mafb-si RNA组中Mafb m RNA表达量明显降低(P细胞标志物α-SMA,Vimentin明显降低(P0.05)。结论:成功构建Mafb基因敲除小鼠模型,小鼠出现尿道下裂表型及尿道缝处细胞中E-cadherin显著降低和α-SMA表达增加;抑制Mafb基因表达也可使人包皮成纤维细胞系的EMT相关标志物表达发生改变,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用奠定了基础。

关键词： Mafb 基因敲除尿道下裂包皮成纤维细胞 EMT