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中国兽医学报 2001年第4期21卷 359-361页

作者：万忠海何畅江禹甄勇刘晓明朱平解放军军需大学军事兽医研究所吉林长春130062 白求恩医科大学吉林长春130021

将绿脓杆菌外毒素 A( PEA)受体结合区基因重组质粒 p ET-2 8( c) +B1 0 转入大肠杆菌 BL2 1 ( DE3)plys,诱导表达出的重组 PEA受体结合区蛋白包涵体经脲素洗涤后 ,Sephacryl-2 0 0分子筛层析 ,DEAE-Sepharose FF离子交换层析获得纯度为 ... 详细信息

将绿脓杆菌外毒素 A( PEA)受体结合区基因重组质粒 p ET-2 8( c) +B1 0 转入大肠杆菌 BL2 1 ( DE3)plys,诱导表达出的重组 PEA受体结合区蛋白包涵体经脲素洗涤后 ,Sephacryl-2 0 0分子筛层析 ,DEAE-Sepharose FF离子交换层析获得纯度为 95.8%重组蛋白包涵体。将该蛋白作免疫原免疫小鼠后 ,用 PEA进行不同时间攻毒 ,观察到最佳保护时间为 1 4 d左右 ;

关键词：重组绿脓杆菌外毒素A 动物保护实验免疫受体结合区蛋白

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鸡传染性支气管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究

鸡传染性支气管炎病毒H120型M、N基因的免疫原性研究

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作者：孙晓云上海海洋大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种鸡的急性传染性疾病,通过接触相互传染,各年龄的鸡都可发病,该病在世界范围流行十分广泛,是侵害养... 详细信息

鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种鸡的急性传染性疾病,通过接触相互传染,各年龄的鸡都可发病,该病在世界范围流行十分广泛,是侵害养鸡业的最严重的传染病之一,被世界动物卫生组织（OIE）列为禽病B类传染病。由于鸡传染性支气管炎病毒（IBV）极易发生变异,经常出现新的血清型,并且不同血清型之间交叉感染现象严重,不同毒株之间基本没有交叉保护力,所以该病的免疫非常困难,鸡群内呈爆发式发生,给养禽业带来巨大的经济损失。本研究对IBV H120株基因序列进行分析,将H120株M基因和N基因构建到真核表达载体中,并对重组质粒的免疫原性进行了研究,为研制IB的DNA疫苗提供依据。1.从GenBank上下载登录号为FJ888351.1的IBV H120型的基因序列,并对其基因序列进行分析,IBV基因组编码的结构蛋白主要有3种,其中N蛋白最为保守,与病毒RNA的合成有关,并且N蛋白上有重要的抗原决定簇;而M蛋白的保守性仅次于N蛋白,可能与核衣壳蛋白结合,决定了病毒的出芽位置,在病毒复制过程中起一定作用,部分抗原决定簇也在M基因上存在。利用PrimerPremier5.0针对IBV-M和IBV-N基因分别设计一对引物,采用RT-PCR试验扩增出具有免疫保护作用的抗原基因M和N基因,通过对这两个基因的测序进行分析发现,IBV-M基因序列含有大约678个碱基,编码225个氨基酸;IBV-N基因序列含有大约1230个碱基,编码410个氨基酸。将其与GenBank上登录的其他毒株进行比较,发现其变异性小,同源率很高,其中IBV-M基因与其他毒株核苷酸序列同源性为84.7%00%之间,相对应的氨基酸同源性为86%00%;IBV-N基因与其他毒株核苷酸序列同源性为90.2%00%之间,相对应的氨基酸同源性为91%00%之间。2.将扩增出的IBV-M基因和IBV-N基因用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,亚克隆到pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经菌落筛选和测序,鉴定出正确的阳性克隆,完成真核表达载体的构建。将重组质粒转染到Vero细胞中,进行免疫荧光试验,可以检测到IBV-M基因和IBV-N基因在细胞内表达,并具有一定的免疫原性。这为进一步研究IBV的DNA疫苗提供了理论数据。3.将构建的真核表达载体用脂质体PEI25000按照N/P=8进行包裹,制成核酸疫苗,通过腿部肌肉多点注射进行动物免疫试验,10日龄首免,21日龄加强免疫一次,二免后用IBV H120型毒株进行攻击,连续观察15天后全部扑杀,取肾脏组织进行病毒的检测,其中H120弱毒疫苗组病毒检出率为33.3%,M质粒组病毒检出率为50%,N质粒组病毒检出率为40%,单基因的病毒检出率略高于弱毒苗组,而M+N混合质粒组病毒检出率仅为20%。明显低于弱毒苗组和单基因组。本研究制备的用PEI25000包裹的DNA疫苗,对IB的防控有重要的意义。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 M基因 N基因核酸疫苗动物保护实验

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日本血吸虫肌钙蛋白T（SjTnT）的初步研究

日本血吸虫肌钙蛋白T（SjTnT）的初步研究

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作者：王馨茁上海师范大学

学位级别：硕士

血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采用了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺难于消灭以及药物不能防止再感染等原因,血吸虫病仍是我国... 详细信息

血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采用了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺难于消灭以及药物不能防止再感染等原因,血吸虫病仍是我国一个重要的公共卫生问题。研究开发有明确保护作用的抗血吸虫疫苗是目前血吸虫病防控研究中的热点之一。本实验室在前期免疫蛋白质组学的研究中发现,肌钙蛋白T(troponin T, TnT)可以被日本血吸虫感染10天后的东方田鼠血清和小鼠血清所识别,但不被这两种未感染动物的血清所识别,推测其可能在诱导抗血吸虫感染的免疫应答中具有重要作用。本研究在此基础上对SjTnT基因进行了克隆,分析了该基因的生物学特性,在大肠杆菌中表达并纯化了重组抗原,评估其在小鼠中诱导的免疫保护效果,为深入开展该基因的生物学功能研究,及进一步明确SjTnT重组抗原作为疫苗候选分子的潜力提供了基础。本文根据GenBank中SjTnT基因序列,设计特异引物,利用PCR技术从日本血吸虫28d虫体cDNA中扩增得到特异的DNA片段。测序结果表明其为SjTnT的ORF片段,长度为975bp,编码324个氨基酸,与SmTnT同源性达到90%以上。编码蛋白理论分子量为38.4kDa,理论等电点为6.03,生物信息学分析显示该蛋白二级结构主要为超螺旋,亲水性较强,无信号肽和跨膜结构域,具有较强的抗原性。进一步利用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ将SjTnT基因片段定向克隆至pET28a(+)载体中,成功构建了重组表达质粒pET28a(+)-SjTnT,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,并纯化得到重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,收集血清。Western blotting分析结果表明重组蛋白能被重组蛋白免疫血清识别,说明具有良好的抗原性。利用免疫组化方法观察SjTnT蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTnT主要分布在日本血吸虫体被表膜,实质器官也有部分分布。纯化制备重组抗原rSjTnT,结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验,结果和对照组比较,rSjTnT在BALB/c小鼠中分别诱导了33.89%(P保护机制研究表明,随着免疫次数的增加,免疫鼠血清中特异性的IgG抗体水平持续升高,IgG1/IgG2a比值呈升高趋势。结果提示,重组蛋白rSjTnT可诱导小鼠产生一定的保护作用,是一种有潜力的抗血吸虫病候选疫苗分子。

关键词：日本血吸虫 SjTnT 抗原性动物保护实验

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增强型绿色荧光蛋白标记技术对日本血吸虫新基因***的研究

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中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会

作者：朱传刚沈滨黄劭鹏李浩陆珂林矫矫陈建秀中国农业科学院上海家畜寄生虫研究所上海动物生物技术中心中国科学院上海神经生理研究所南京大学生物学系

采用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记技术研究日本血吸虫睾丸增强基因翻译蛋白((Schistosomia japoniun testis-enhanced gene transcript,***)在人胚肾细胞中的分布;同时,观察*** 的DNA 疫苗的免疫保护效果,探讨其作为疫苗候选分子的可能... 详细信息

采用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记技术研究日本血吸虫睾丸增强基因翻译蛋白((Schistosomia japoniun testis-enhanced gene transcript,***)在人胚肾细胞中的分布;同时,观察*** 的DNA 疫苗的免疫保护效果,探讨其作为疫苗候选分子的可能性.方法:构建*** 的真核表达载体***,磷酸钙沉淀法将*** 重组载体导入人胚肾细胞,使*** 与EGFP 进行融合表达。通过荧光显微镜观察融合蛋白的表达分布。利用构建的真核表达载体*** 免疫昆明小鼠,进行攻击保护实验。用ELISA 测定小鼠体内的抗体水平。结果:表达的***-EGFP融合蛋白主要集中分布在内质网系统,特别是细胞核膜上,同利用生物信息学对*** 的预测一致.该基因的DNA 疫苗免疫动物的保护实验证明*** 与pEGFP-N 对照组相比,实验组获得22.2%的减虫率、37.8%的肝减卵率,对小鼠有显著的减虫作用(P实验组小鼠IgG 抗体水平显著升高。结论:日本血吸虫*** 是一分布于内质网系统中的膜蛋白,作为DNA 疫苗有一定的抗血吸虫作用,具有疫苗研究开发价值.

关键词：日本血吸虫增强型绿色荧光蛋白日本血吸虫睾丸增强基因翻译蛋白Sj.TEGT DNA 免疫动物保护实验

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柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及其免疫保护性评价

柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及其免疫保...

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：杨斯涵韩红玉赵其平朱顺海黄兵翟颀李莎梁思婷董辉杨亮宇中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室云南农业大学动物科学技术学院上海师范大学生命与环境科学学院

为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,EtSIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA为模板,PCR扩增出EtSIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核... 详细信息

为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,EtSIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA为模板,PCR扩增出EtSIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核表达载体pCAGGs连接,连接产物经PCR和酶切鉴定,再经测序鉴定正确后,分别转染DF-1细胞和BHK细胞进行表达,分别用Western blot和间接免疫荧光鉴定EtSIR2基因的表达情况。结果,成功扩增了EtSIR2基因,长度为909 bp,Western blot可见大小约为37 kDa的表达蛋白条带,间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了EtSIR2的真核表达质粒pCAGGs-EtSIR2,并能在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达。将构建的重组质粒pCAGGs-EtSIR2、重组蛋白EtSIR2、空质粒pCAGGs分别免疫7日龄雏鸡,同时设置非免疫攻虫组和非免疫非攻虫组。14天后进行二免,二免后第7d除了非免疫非攻虫组之外,其余各组用柔嫩艾美耳球虫上海株孢子化卵囊1×10进行攻虫,检测鸡的增重、盲肠病变记分、卵囊产量等生理指标。同时,在不同时间段采血和脾脏,分别进行抗体水平和淋巴细胞增殖与亚群的检测,通过多个指标进行免疫效果评价。结果显示,重组质粒对免疫期间的增重影响最小。重组质粒组攻虫后的增重与健康非免疫组相当,明显高于攻虫非免疫组(p0.05)。重组质粒组和重组蛋白组的病变记分和卵囊减少率相当,均明显低于攻虫非免疫组(p0.05);各组之间CD8/CD3T差异不显著。结果表明,重组质粒和重组蛋白对感染球虫鸡均具有一定的保护效果,但在生理指标方面,重组质粒组稍好于重组蛋白组,而重组蛋白在诱导抗体水平和T淋巴细胞水平方面稍优于重组质粒组。

关键词：柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2 真核表达动物保护实验

来源： cnki会议评论

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创办特色学校　推进素质教育

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云南教育（小学教师） 1997年第12期 5-5页

作者：彭琨昆明铁路局南站小学

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